Исследование характера взаимодействия генов
В последнее время становится ясно, что многие клеточные функции вырождены. Любой процесс находится под контролем нескольких путей регуляции, перекрывающихся и взаимодействующих. Существуют семейства генов, кодирующие гомологичные белки, сходные, или различающиеся по регуляции, локализации в клетке и т.п. Поэтому, если отклонированы гены, мутации в которых влияют на один и тот же процесс, или модифицируют друг друга, необходимы более детальные исследования характера их взаимодействия. При этом исследуют фенотип двойных мутантов, или эффекты гиперэкспрессии одного из генов на функцию другого.
Если гены действуют параллельно, то следует ожидать суммации их эффектов. У генов со взаимнозаменимыми функциями изменения фенотипа будут наблюдаться только при одновременной дизрупции всех этих генов ( синтетические летали, т.е. летали, возникающие в результате объединения мутантных аллелей двух генов, по отдельности не дающих летального эффекта ), и мутации одного гена можно изучать только на фоне дизрупции всех остальных. В качестве примера можно привести гены TPK1 , TPK2 , TPK3 , кодирующие каталитическую субъединицу A-киназы . При авторегуляции могут возникать необычные эффекты. У некоторых генов фенотипическим проявлением обладают только точковые мутации, но не дизрупция (например, ген DBF ). Это означает, что гены со сходными функциями могут компенсировать дефект только, если в клетке отсутствует продукт мутантного гена. У генов с частично взаимозаменяемыми функцмями дизрупция каждого обладает самостоятельным фенотипическим проявлением, при дизрупции дополнительных генов эффект усиливается (например, гены CLN1 , CLN2 , CLN3 ). Продукты таких генов участвуют в параллельных путях регуляции, или выполняют одну и ту же функцию в различных физиологических условиях.
У мутантов rad выделено три эпистатических группы, соответствующие разным путям репарации. При объединении мутантов из различных эпистатических групп радиочувствительность усиливается.
Примером различия функций при гомологии продуктов являются термошоковые гены SSA. Неполная взаимозаменяемость связана с различиями в регуляции. Анализ фенотипа двойных и тройных дизрупций свидетельствует о том, что SSA1 и SSA2 необходимы для выживания при повышенной температуре, SSA4 - при пониженной температуре, SSA3 - при голодании. Полная взаимозаменяемость этих генов проявляется при освобождении от клеточного контроля: гиперэкспрессия SSA1 восстанавливает жизнеспособность дизрупции генов SSA1, SSA2 и SSA4.
Если продукты генов действуют последовательно, то у двойных мутантов эффект не суммируется. Если гены регуляторного каскада действуют в одном направлении ( два активатора, два репрессора), то фенотип тот же, что и у одиночных, если в противоположных (репрессор и активатор ), то проявляется фенотип одного из мутантов. Мутации rme1 приводят к индукции споруляции у штаммов а/а и alfa/alfa, а мутации ime1 блокируют споруляцию. У двойных мутантов rme1ime1 тот же фенотип, что и у мутантов ime1, следовательно, ген IME1 действует позже гена RME1 . Подтверждением служит тот факт, что увеличение дозы гена IME1 подобно действию мутации rme1, а увеличение дозы гена RME1 - действию мутации ime1. В одном направлении действуют мутации ime1 и ime2. У двойных мутантов ime1ime2, подобно мутантам ime1 и ime2 нарушена споруляция. В этом случае фенотип двойных мутантов и сверхэкспрессия одного гена на фоне аллели дикого типа другого гена не информативны, так как приводят к одному и тому же фенотипу (Ime-). Определить порядок генов позволяет гиперэкспрессия на фоне мутантной аллели. Амплификация гена IME2 подавляет мутацию ime1, но амплификация IME1 не подавляет мутацию ime2. У мутантов ime2 транскрибируется ген IME1, а у мутантов ime1 ген IME2 не транскрибируется. Следовательно, ген IME2 действует после IME1.
Если мутации нарушают один и тот же процесс, но обладают разным плейотропным проявлением, определить порядок их действия можно только из фенотипа двойных мутантов, не изучая сверхэкспрессию. Мутации cdc28, cdc4, cdc7 блокируют клеточный цикл (действуют в одном направлении) и приводят к определенной клеточной морфологии, специфической для каждого мутанта. Оказалось, что у cdc28cdc4 и cdc28cdc7 фенотип подобен cdc28. Это означает, что cdc28 действует раньше cdc4 и cdc7. У cdc4cdc7 фенотип cdc4. Следовательно, порядок действия генов: cdc28 -> cdc4 -> cdc7 ( Hereford, Hartwell, 1974 ). Продукты этих генов участвуют в передаче сигналов из внешней среды.
Другой пример - взаимодействие генов SEС, продукты которых, как предполагается, образуют структурные белковые комплексы. Среди мутантов с нарушениями транспорта из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи выделяют класс I с нормальной и класс II с повышенной внутриклеточной концентрацией микровезикул. Оказалось, что мутанты класса I эпистатируют мутантов класса II, следовательно, действуют раньше ( Kaiser, Schekman, 1990 ).
Гены ste2 , ste4 и cdc36 , cdc39 действуют в противоположных направлениях. У cdc нарушен клеточный цикл, но возможна копуляция, a ste нормально делятся, но стерильны. cdc36 и cdc39 эпистатируют ste2, а ste4 - cdc36 и cdc39. В этом случае, в отличие от двух предыдущих, проявляется фенотип той мутации, которая действует позже.
