CDC28 Ген и циклины
Ген CDC28 - представитель стартовых мутантов класса 1. Фенотип этой мутации и характер взаимодействия с другими генами cdc свидетельствуют о ключевой роли этого гена в регуляции не только митоза , но и мейоза . CDC28 необходим для формирования веретена деления и инициации сегрегации хромосом в первом и втором делении мейоза ( Shuster, Byers, 1989 ). Поэтому можно предположить, что и в митозе CDC28 нужен дважды: для перехода G1->S и G2->M. В митотическом цикле его дефект наиболее выражен на стадии G1 , но у некоторых мутантов cdc28 остановка происходит на стадии G2 ( Piggot et al., 1982 ).
Ген cdc28 был клонирован ( Lorenz, Reed, 1984 ), и с помощью анализа аминокислотной последовательности выяснили, что он кодирует протеинкиназу ( Reed et al., 1985 ). CDC28p активен только в виде комплекса с другим белком. Этот комплекс появляется только на стадии G1 и исчезает под воздействием внешних условий на стадии G2 ( Wittenberg, Reed, 1988 ; Mendenhall et al., 1987 ).
Для выявления компонентов белкового комплекса, в котором находится протеинкиназа CDC28p, клонировали гены, способные при сверхэкспрессии супрессировать мутацию cdc28: CKS1 , CLN1 и CLN2 . Ген CKS1 при сверхэкспрессии может супрессировать только температурочувствительную мутацию cdc28, но не дизрупцию , следовательно продукты этих генов работают в комплексе , и CKS1p - активатор CDC28p. Дизрупция гена CKS1 приводит к остановке деления на стадии G1 ( Hadwiger et al., 1989 ). Дизрупция генов CLN1 и CLN2 по отдельности не сказывается на фенотипе, а их совместная дизрупция не летальна, но приводит к сильному замедлению роста культуры и увеличению размера клеток, вступающих в деление.
Обнаружен ген CLN3 ( DAF1 , WHI1 ), дизрупция которого на фоне мутаций cln1 и cln2 приводит к летальности. Увеличение копийности CLN3 ( Cross, 1988 ; Sudbery et al., 1980 ) сокращает стадию G1, делеции этого гена - удлиняют. CLN3 не полностью компенсирует дефект мутаций в генах CLN1 и CLN2, следовательно обладает дополнительными функциями. Оказалось, что сверхэкспрессия гена CLN3 не приводит к супрессии мутаций cdc28 ( Tyers et al., 1990 ; Nash et al., 1988 ). В связи с этим возникает предположение, что ген СDС28 не единственный регулятор митоза.
Гены CLN кодируют циклины - короткоживущие белки-регуляторы клеточного деления. Такие белки были впервые обнаружены у беспозвоночных. Было показано существование двух типов циклинов - циклин A и циклин B, связанных с регуляцией перехода из стадии G2 в стадию M. Гены CLN дрожжей кодируют принципиально новый класс циклинов, участвующих в регуляции перехода из стадии G1 в стадию S. Гены CLN экспрессируются на стадии G1 ( Wittenberg et al., 1990 ).
Продукты CLN, как и другие циклины, совершают быстрый кругооборот. В С-терминальной части циклинов имеется последовательность, необходимая для их быстрой деградации. В гене CLN1 была получена мутация CLN1-2, которая оказалась делецией участка, кодирующего С-терминальную часть продукта этого гена. Аналогичная мутация была получена в гене CLN3 ( Nash et al., 1988 ). Гиперэкспрессия мутантной аллели CLN1-2 супрессирует мутацию cdc28, но интеграция этой аллели в хромосому у штаммов CDC28+ приводит к сокращению длительности стадии G1 и уменьшению размера клеток.
Высказана гипотеза о зависимости активации гена CDC28 от концентрации циклинов. Для возобновления клеточного деления после кратковременной остановки необходим белковый синтез - очевидно накапливаются короткоживущие регуляторы - циклины ( Moore, 1988 ). Предположительно, циклины активируют cdc28p , что необходимо для перехода G1->S. Понижение концентрации циклинов в клетке может быть связано с их ускоренной деградацией (активация протеолиза) или подавлением их синтеза. Сигнал о голодании приводит к общему подавлению биосинтеза, термошок - к активации системы протеолиза ( Richardson et al., 1989 ).
Циклины, регулирующие активность CDC28p на стадиях G2->M и пахитены , пока не найдены.
Мутация cdc28 и мутации в его регуляторах cdc36 и cdc39 (необходимых для активации cdc28 и в митозе , и в мейозе ) не проявляются при росте на неферментируемых источниках углерода ( Shuster, 1982 ). Это свидетельствует о том, что на неферментируемых источниках углерода дефект мутации cdc28 компенсируют другие гены, которые работают только в отсутствии глюкозы.
Регуляторами деления при выращивании на глюкозе, наряду с геном cdc28, предположительно являются также два гомологичных гена DBF . Температурочувствительные мутанты в гене DBF2 приводят к задержке стадии G1 и окончательному блоку на стадии перехода G2->M. Продукт гена DBF2 - это протеинкиназа. Дизрупция гена DBF2, в отличие от температурочувствительных мутаций в этом гене, не приводит к остановке клеточного цикла. Этот неожиданный результат авторы объясняют тем, что члены семейства генов DBF могут компенсировать отсутствие функции гена (из-за делеции или дизрупции), но не компенсируют дефект, связанный с присутствием в клетке мутационно измененного продукта. Это возможно при наличии авторегуляции ( Parkes, Johnston, 1990 ; Toyn, Johnston, 1990 ). Если мутация cdc28 приводит к неполному блоку на стадии пахитены, следовательно, есть гены частично компенсирующие дефект cdc28 ( Shuster, Byers, 1989 ).
Ген cdc28 - гомолог гена cdc2 Schizosaccharomyces pombe . Функции этих генов взаимозаменимы. Гены CKS1 и CLN оказались гомологами регуляторов cdc2 Sch.pombе suc1 u cdc13 ( Nash et al., 1988 ). Система регуляции cdc28/cdc2 высококонсервативна. Продукт гена cdc2 может заменять фактор MKF (регулятор перехода G2->M в клетках высших эукариот).
