Предохранители и рибопереключатели
В некоторых случаях переключатель имеет лишь небольшое временное окно, чтобы связать свой лиганд и осуществить регуляцию. Такие переключатели называются кинетическими (kinetically driven), в отличие от термодинамических (thermodynamically driven), которые связывают лиганд уже в полностью синтезированном состоянии. Проблема кинетической регуляции обычно возникает для рибопереключателей, вызывающих аттенюацию транскрипции , поскольку они должны успеть сработать до того, как РНКП пройдет терминатор транскрипции.
Первый описанный кинетический переключатель - один из FMN-связывающих аптамеров . FMN сенсор ( RFN-элемент ) расположен перед опероном биосинтеза флавинмононуклеотида B. subtilis , ribDEAHT . Связывание FMN с рибопереключателем вызывает формирование терминаторной шпильки и прекращает транскрипцию оперона. На пути движения РНКП по лидерному участку имеются два паузирующих участка, задержка фермента на которых создает временное окно, в которое FMN успевает связаться с насцентной РНК и вызвать терминацию транскрипции [ Wickiser, 2005 ]. В опытах in vitro увеличение скорости движения РНКП или удаление участков пауз приводило к тому, что для подавления транскрипции требовалась более высокая концентрации FMN [ Wickiser, 2005 ]. Интересно, что похожий RFN-элемент расположен перед геном ypaA B. subtilis , кодирующим FMN-пермеазу , однако в этом случае образовавшаяся при связывании FMN структура закрывает доступ рибосомы к сайту связывания рибосомы, в результате чего ингибируется инициация трансляции [ Winkler, 2002 ]; в этом случае тот же рибопереключатель работает уже в термодинамическом режиме.
Еще один интересный пример двух похожих аптамеров , которые различаются принципом регуляции, показан для пары рибопереключателей pbuE B. subtilis и add Vibrio vulnificus ( Рис. 9 ). В отличие от FMN-аптамера, оба относятся к довольно редкому типу "включающих" переключателей. pbuE при связывании аденина разрушает внутренний терминатор транскрипции, а add высвобождает сайт связывания рибосомы, делая возможной инициацию трансляции [ Lemay, 2011 ].
При этом полноразмерный регулятор pbuE демонстрирует весьма слабую аффинность к аденину, а эффективность антитерминации in vitro при добавлении аденина значительно увеличивается при добавлении фактора NusA , стимулирующего паузирование РНКП и, следовательно, увеличивающего время на связывание аптамера с лигандом. Таким образом, pbuE работает в кинетическом режиме. В свою очередь второй регулятор, add, эффективно и обратимо связывает аденин с высокой аффинностью, и работает в термодинамическом режиме [ Lemay, 2011 ].
Таким образом, работающие в кинетическом режиме экспрессионные платформы - это своего рода предохранители, срабатывающие или не срабатывающие только один раз, а в термодинамическом - именно переключатели, теоретически многоразовые. При этом по своей природе аттенюатор транскрипции имеет возможность отреагировать на сигнал извне лишь единожды, при синтезе РНК, а вот аттенюатор трансляции теоретически может переключаться несколько раз, вводя и выводя мРНК из активной трансляции. Близкий аналог последнего механизма, известный как маскирование и демаскирование мРНК , широко используется в регуляции экспрессии эукариотических генов [ Spirin, 1994 ]. Теоретически логично было бы ожидать, что термодинамические переключатели должны чаще встречаться в случае трансляционной регуляции. Тем не менее, пока неясно, насколько важна эта возможность многократного переключения термодинамических РНК-элементов для регуляции экспрессии генов прокариот. Например, описанный выше pH-сенсор перед alx является именно кинетическим РНК-предохранителем, хотя и регулирует инициацию трансляции.
