Рибозимные рибопереключатели
По оригинальному механизму действует рибозимный рибопереключатель , расположенный перед геном glmS синтеза глюкозамин-6-фосфата (GlcN6P) у грамположительных бактерий. Он регулирует экспрессию генов, расщепляя мРНК [ Barrick, 2004 ; Winkler, 2004 ]. Этот переключатель был обнаружен в результате масштабного биоинформатического поиска возможных рибопереключателей в геномах грамположительных организмов [ Barrick, 2004 ]. Поиск проводился следующим образом: выделялись межгенные регионы крупных размеров (медианный размер для уже известных рибопереключателей составлял 330 нт, тогда как средняя длина межгенных участков - только 152 нт), также учитывалась возможность образования различных шпилек и ряд других параметров. Почти всегда определенные элементы находились строго перед генами и оперонами с определенной функцией [ Barrick, 2004 ]. В отличие от других выявленных в процессе скрининга переключателей, рядом с glmS исследователям не удалось идентифицировать никакого терминаторного элемента или возможного регулятора трансляции, поэтому принцип регуляции был неочевиден. Позже выяснилось, что лидерная РНК glmS представляет собой рибозим , который после узнавания конечного продукта работы фермента GlmS , глюкозамин-6-фосфата (GlcN6P) , катализирует реакцию авторасщепления РНК [ Winkler, 2004 ].
Необычна структура этого рибопереключателя. В большинстве случаев именно связывание лиганда с рибопереключателем (в процессе или уже после транскрипции РНК) стабилизирует определенную структуру РНК, благодаря чему и осуществляется регуляторный эффект: формирование терминатора или высвобождение/скрытие сайта связывания рибосомы. Принцип функционирования glmS сильно отличается от описанного выше. Были определены структуры рибозима glmS в свободном состоянии, при связывании с лигандом и сразу после реакции авторасщепления, и все они оказались очень близки. Таким образом, процессы связывания и катализа glmS происходят с минимальными изменениями конформации РНК [ Klein, 2006 ]. Более того, структура рибозима настолько стабильна, что реакция расщепления может происходить даже в кристалле - до этого подобный эффект был показан только для одного рибозима, рибосомы [ Klein, 2006 ]. Связавшийся с этой структурой GlcN6P выступает кофактором в реакции авторасщепления glmS РНК [ Collins, 2007 ], в результате которой отщепляется 62-нуклеотидный фрагмент с 5'-конца транскрипта и образуется 5'-OH конец. После этого РНКаза J1 , по всей видимости, благодаря своей 5'-3' экзонуклеазной активности, расщепляет остаток РНК с 5'-OH конца, и трансляция останавливается [ Collins, 2007 ]. Другой рибозимный переключатель описан у бактерии Clostridium difficile .
Переключатель состоит из двух функциональных доменов: сенсора цикло-ди-GMP и GTP-зависимого рибозима, представляющего собой автосплайсирующийся интрон типа I. Линкер между доменами как раз является сплайс-сайтом [ Lee, 2010 ]. При связывании аптамером цикло-ди-GMP сплайс-сайт высвобождается из вторичной структуры. Вырезание фрагмента и сшивание концов РНК при сплайсинге помещает SD-последовательность , расположенную в одной из шпилек цикло-ди-GMP узнающего аптамера, на нужном расстоянии от стартового кодона нижележащей рамки считывания, и таким образом делает возможной трансляцию нижележащего гена.
