Стабильность короткого транскрипта микроцинового оперона
Короткий транскрипт микроцинового оперона mccA чрезвычайно стабилен и связан с рибосомами in vivo.
Короткий транскрипт mccA может образовываться либо при терминации транскрипции, либо посредством расщепления более длинного транскрипта в межгенном участке mccA - mccB . Расщепление транскрипта в межгенном участке приводило бы к появлению дополнительного 5'-конца, расположенного за геном mccA. Однако в реакции удлинения праймера, комплементарного началу гена mccB, детектировался только один продукт, 5'-конец которого совпадал с началом короткого транскрипта mccA. В случае появления короткого транскрипта вследствие терминации транскрипции 5'-концы короткого и длинных транскриптов должны совпадать, что и наблюдалось экспериментально.
Высокое соотношение между равновесными концентрациями моно- и полицистронного транскриптов mcc могло бы обеспечиваться как эффективной терминацией в межгенном участке, так и различиями в стабильности этих транскриптов (возможно также сочетанное действие обоих этих факторов).
Чтобы проверить версию о различной стабильности mccA и полицистронного транскрипта, были проведены эксперименты с добавлением ингибитора инициации транскрипции рифампицина к культуре, синтезирующей микроцин . Результаты представлены на Рис. 12 . Как видно, время полужизни полицистронного транскрипта составляет лишь несколько минут, и таким образом совпадает со значениями, известными для большинства транскриптов E. coli [ Bernstein, 2002 ]. Стабильность короткого транскрипта mccA, напротив, оказалась чрезвычайно высокой - количество этого транскрипта остается практически неизменным в течение 20 минут после добавления рифампицина, т.е. сравнимо со временем, необходимым для деления клетки. Транскрипты, которые находятся в цитоплазме длительное время, могут утерять 5'-трифосфат [ Celesnik, 2007 ]; возможно, именно это объясняет резкое снижение прочтений короткого транскрипта mccA после обработки TEX ( Рис. 11 ,А).
Из литературы известно несколько факторов, которые могут приводить к высокой стабильности транскриптов. Так, обычно более стабильны короткие транскрипты и транскрипты с 3'-концевой шпилькой [ Stern, 1991 ; Carrier, 1997 ; Causton, 1994 ; Chen, 1988 ]. Кроме того, мРНК стабилизируется при связывании рибосом [ Deana, 2005 ]. Чтобы определить, связан ли транскрипт mccA с рибосомами, было проведено центрифугирование клеточных лизатов в градиенте сахарозы, позволяющее разделить фракции рибосом и свободной РНК. С образцами РНК, выделенной из этих фракций, проводили Нозерн-блот гибридизацию с олигонуклеотидным зондом, специфичным к mccA ( Рис. 13А ). Как видно, короткий транскрипт детектируется только в РНК, выделенной из рибосомной фракции. Это свидетельствует о наличии короткого транскрипта mccA исключительно в этой фракции, либо о быстрой деградации не связанного с рибосомами транскрипта.
Для инициации трансляции бактериальных мРНК необходимо наличие последовательности Шайна-Дальгарно , с которой связывается рибосома, и старт-кодона, с которого начинается трансляция, расположенного на расстоянии 6-10 нуклеотидов от этой последовательности [ Kozak, 1999 ]. Нами были получены мутантные варианты плазмиды с кластером mcc , в которых был изменен один из этих двух элементов. В одном случае старт-кодон ATG гена mccA был заменен на TAA (такая плазмида была названа "ATG1->TAA" ), а в другом - внесена мутация в последовательность Шайна-Дальгарно (такая плазмида была названа "SD" ). Клетки, несущие мутантные плазмиды, не синтезировали McC. Концентрация полицистронного транскрипта в таких клетках практически не изменялась по сравнению с контрольными клетками, несущими исходную плазмиду ( Рис. 13 ,Б, средняя панель, ср. дорожки 1 и 2, 3). Мутация в последовательности Шайна-Дальгарно приводила к полному исчезновению транскрипта mccA ( Рис. 13 ,Б, верхняя панель, дорожка 3). В случае замены старт-кодона на стоп-кодон транскрипт по-прежнему детектировался ( Рис. 13 ,Б, верхняя панель, дорожка 2), хотя его количество было понижено по сравнению с контролем.
