Маркеры микросателлитные
Часто используемыми в диагностике типами полиморфизма ДНК являются короткие повторяющиеся последовательности, или микросателлиты. Микросателлитные локусы с большой частотой встречаются в геноме и достаточно равномерно распределены по длине генома. В основе полиморфизма микросателлитов лежат различия в числе повторяющихся единиц. Использование микросателлитов в качестве маркерных локусов позволяет в большинстве случаев легко проследить в родословной передачу мутантного гена.
Микросателлитные локусы анализируют с помощью PCR реакции. Этот подход был предложен J.L. Weber с соавт. в 1989 г. [ Weber J.L. e. a., 1989 ]. Он основан на использовании диспергированных повторов (dC-dA)n((dG-dT)n, которые являются одним из наиболее распространенных семейств повторов в человеческой ДНК. Авторы показали, что блоки (dC-dA)n((dG-dT)n полиморфны по длине среди разных индивидуумов, что позволяет использовать их в качестве генетических маркеров. Так, например, проведенное ими сравнение описанных в литературе (dC-dA)n((dG- dT)n последовательностей, которые были клонированы 2 или более раз, показало, что в 7 случаях из 8 их длины различны. Но, что не менее важно, авторы предложили эффективный метод анализа этих маркеров - их амплификацию с помощью PCR с последующим разделением продуктов реакции на полиакриламидном геле, что позволило резко повысить чувствительность и скорость анализа по сравнению с традиционными методами, основанными на гибридизации геномных блотов.
Впоследствии были разработаны чрезвычайно эффективные методы анализа микросателлитов. Diehl с соавт. [ Diehl S.R. e. a., 1990 ] предложили использовать праймеры, меченые флуоресцентной краской, для PCR анализа динуклеотидных повторов с последующей детекцией продуктов реакции с помощью автоматического лазерного детектора фрагментов ДНК.
Ziegle с соавт. [ Ziegle J.S. e. a., 1992 ] разработали автоматизированный метод анализа тандемных повторов с помощью стандартных автоматических секвенаторов ДНК. Они предложили метить праймеры 3 различными флуоресцентными красителями, что упозволяет анализировать сразу 3 образца в одной дорожке (четвертый краситель используется для мечения стандарта молекулярного веса, который наносится в ту же дорожку). Это позволило резко поднять производительность такого метода и повысить точность определения длин фрагментов (до (0,05 п.о.).
Эффективные методы анализа позволили широко использовать этот тип маркеров в различных проектах картирования.
Так, например, использование коротких тандемных повторов позволило обнаружить локусы, ответственные за ряд широко распространенных многофакторных заболеваний в модельных организмах (таких как локусы, связанные с регуляцией кровяного давления у мышей с наследственной гипертонией [ Hilbert P. e. a., 1991 ], генов, связанных с эпилепсией и аутоиммунным диабетом у мышей [ Rise M.L. e. a., 1991 , Todd J.A. e. a., 1991 ].
Использование микросателлитов в качестве маркерных локусов.
