Картирование: Анализ клонированной ДНК
Существует два типа подходов к созданию физических карт геном а - "сверху вниз" и "снизу вверх". Рестриктное картирование является исторически первой методикой, использующей подход "сверху вниз". Подход "снизу вверх" чаще всего реализуется при составлении карт перекрывающихся клонов.
Этот подход предполагает предварительное клонирование геномной ДНК изучаемого организма. Полученные клоны с помощью тех или иных методов собирают в контиги. Этот этап работы отличается значительной трудоемкостью, но после успешного завершения дает возможность очень быстро проводить картирование любых типов молекулярно-генетических маркеров.
Наиболее известным и нашумевшим примером массированного использования такого подхода является "карта человеческого генома первого поколения" , опубликованная в конце 1993 г. D. Cohen, I. Chumakov и J. Weissenbach [ Cohen D. ea., 1993 ]. Авторы возглавляют массированные исследования, проводимые в Genethon и CEPH по изучению генома человека и сумели эффективно объединить результаты генетического картирования и клонирования человеческой ДНК. В качестве экспериментального материала для проводимых работ использовали библиотеку из 33 000 YAC со средним размером вставки около 900 кб, содержащую около 9 эквивалентов генома.
На первом этапе были получены результаты рестриктного фингерпринтирования всех клонов этой библиотеки. Для этого использовалась оригинальная методика, суть которой заключается в том, что после расщепления ДНК клона с помощью трех рестриктаз проводили гибридизацию блотов с человек-специфичными средне- повторяющимися последовательностями [ Belanne-Chantelot C. ea., 19 ].
Полученные данные позволили выделить группы перекрывающихся клонов, но их одних было недостаточно для составления непротиворечивой карты перекрытия YAC.
Вторым подходом, использованным для определения взаимного перекрытия клонов, были результаты анализа YAC на присутствие 2 100 полиморфных STS, генетическое картирование которых было проведено ранее в CEPH [ Gyapay G. e. a., 1994 ]. В результате скрининга 33 000 клонов библиотеки было установлено, что 1 068 STS содержатся в среднем в 5,52 YAC, а 714 - в 2,05. Таким образом, всего картированные STS содержались в 20% клонов библиотеки. Учитывая средний размер клонов в используемой библиотеке, это само по себе позволило бы покрыть около 20% генома человека.
Однако авторы ставили своей целью добиться максимального покрытия генома человека упорядоченными клонами, поэтому были использованы и другие методы для определения взаимного расположения клонов.
Во-первых, были получены продукты PCR-амплификации ДНК, находящейся между Alu-повторами (Alu-PCR) для более, чем 25 000 YAC. Продукты амплификации были нанесены на фильтры высокой плотности вместе с продуктами Alu-PCR геномной ДНК гибридных клеток, содержащих только одну из человеческих хромосом. Полученные фильтры гибридизовали с продуктами Alu-PCR 5 332 клонов, причем отбирались в основном те клоны, которые содержали STS-маркеры.
Во-вторых, около 500 YAC были картированы на метафазных хромосомах с помощью гибридизации in situ.
Получив этот огромный массив экспериментальных данных, авторы попытались перекрыть разрывы в карте упорядоченных клонов, полученной на основе анализа присутствия картированных на генетической карте генома человека STS в клонах библиотеки. Для этого пытались найти минимальный набор клонов, перекрывающихся по одному или нескольким признакам, которые позволил бы перекрыть промежуток между соседними генетически картированными маркерами. Число клонов, минимально достаточных для такого перекрытия, авторы назвали "уровнем". Таким образом, если 2 STS находятся на одном YAC, говорят о том, что они перекрыта клонами на уровне 1, если нужно 3 клона, чтобы перекрыть их, то говорят, что они перекрыты на уровне 3 и так далее.
Таким способом авторы надеялись обойти проблемы, связанные с химеризмом, присущим библиотекам YAC. Наличие данных, полученных различными методами, позволяет в принципе проводить перекрестную проверку результатов перекрытия клонов и, таким образом, выявлять и отбрасывать ложные контиги.
Естественно, чем выше "уровень" перекрытия, тем большая часть генома будет перекрыта упорядоченными клонами, но и тем ниже будет надежность построенной карты. Например, проверка, проведенная в Центре Изучения Генома Человека в Ливерморе показала, что при использовании исходных экспериментальных данных, полученных в ходе выполнения описанных работ, на уровне 5 возможно перекрыть любые два маркера, присутствующие в геноме человека (G. Lennon, T. Slezak, personal communication). Таким образом, очевидно, что для построения непротиворечивой и надежной карты таким способом необходимо разработать весьма изощренные методы анализа полученных данных, что приводит к тому, что с практической точки зрения невозможно использовать исходные экспериментальные данные без математического аппарата, разработанного в ходе выполнения данного проекта.
