Наследственные болезни: диагностика: молекулярные методы: общие процедуры
Молекулярно-генетические методы - это большая и разнообразная группа методов, в конечном счете предназначенном для для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки последовательности оснований. В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70-80-х годах и последуещего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медики-генетическую практику.
Чтобы познакомиться с сутью и терминалогией молекулярно-генетических методов, ниже будут схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение же этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует специальной подготовки в соответствующих лабораториях.
1. Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех методов. Этот этап реализуется в двух вариантах:
а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток;
б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.
Источником геномной ДНК могут быть дюбые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма. Поэтому такие образцы называются геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала: например, 20-40 мг хориона, 1 мл крови, 5-10 мг культуры клеток. Для осущевствления некоторых методов достаточно 1 каплю крови или соскоб эпителия со щеки, или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно- генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому еще можно добавить, что выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различнных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.
Революцией в диагностике явилась разработка метода полимеразной цепной реакции
2. Рестрикция ДНК на фрагменты является необходимым этапом в молекулярно-генетической диагностике. Этот процесс осуществляется #рестриктазами#, относящимся к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используется несколько десятков разных рестриктаз. Основное их свойство - разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований (редко больше). При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.
3. Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно опрелелить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.
4. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК .
