Rad50: структура ATP-связанного димера
Для изучения структурных изменений, ассоциированных со связыванием ATP, мы кристаллизовали Rad50 совместно с негидролизуемым аналогом ATP AMP-PNP в присутствии ионов Mg2+ (кофактора ABC-ATPаз) и с ATP в отсутствии ионов Mg2+ (для предотвращения гидролиза ATP). Мы определили структуры при разрешениях 2,1 A и 2,6 A соответственно с помощью множественной аномальной дисперсии (MAD) с ATP-селенометионин-Rad50 (Таблица 1). Как в ATP-, так и в AMP-PNP-связанной кристаллических формах, два Rad50cd димеризуется в ориентации "голова к хвосту", при которой каждый Сегмент II взаимосвязан с Сегментом I противоположного Rad50cd ( Рис 4A ). Общая форма димера Rad50cd напоминает неглубокую эллипсоидную чашу габаритами 95x60x40 A.. Взаимодействие димера направлено диагонально по отношению оси эллипсоида и образует желобок глубиной 12 A , 22 A шириной и 65 A длиной вдолm вогнутой стороны димера ( Рис 4B ), расширяющийся к концам. Структура димера ATP-Rad50cd, подтверждает, что AMP-PNP вызывает те же конформационные изменения, что и ATP. Поскольку Mg-AMP-PNP-связанная структура обладает большим разрешением и содержит являющийся ключевым ион Mg2+, детальный анализ изменений Rad50cd, индуцируемых ATP, фокусируется на разрешении комплекса Mg-AMP-PNP-Rad50cd при 2,1 A.
Обе молекулы ATP погружены в область взаимодействия димеров, сформированному подобно сэндвичу между P-петлей (мотив Уолкера A) одного домена Rad50cd и консервативным мотивом узнавания противолежащего Rad50cd ( Рис 4А ). Оба суперспирализованных основания обрамляют желобок, на расстоянии ~25 A друг от друга, таким образом, что спирали расположены почти параллельно друг по отношению к другу и перпендикулярно по отношению к вогнутой стороне "чаши".
Таким образом, в присутствии ATP либо каждый из гомодимеров Rad50 массой 300 кДа ассоциирует со вторым гомодимером Rad50 для образования двойной гантелеподобной структуры массой 600 кДа, либо два домена Rad50cd одного гомодимера Rad50 массой 300 кДа объединяются в структуру, напоминающую по форме наушники ( Рис 4C ). К настоящему времени у Rad50 наблюдались лишь открытые "наушники" (или искаженные гантелеподобные структуры) ( Рис 2D ; Connelly и др., 1998 ), но закрытые "наушники" были обнаружены на электронных микроснимках родственных белков SMC ( Melby и др., 1998 ).
Эти структуры Rad50 указывают на главную роль консервативного мотива узнавания при сборке димера, а также идентифицируют полностью погруженный сайт связывания ATP, напоминающий скрытые сайты связывания триплетов других ферментов. В противоположность этому, у димера, производного от HisP ( Hung и др., 1998 ) расположение как ATP- связывающего сайта, так и мотива узнавания - открытое и периферическое.
Для независимого подтверждения взаимодействия димера Rad50cd мы создали два мутантных Rad50cd для различения поверхностей взаимодействия димера HisP (I74R) и димера Rad50 (S793R), а также изучили их ATP-зависимую димеризацию ( Рис 4D ). S793R находится в области взаимодействия мотивов узнавания димера Rad50 и аналогична мутации в CFTR (S549R), приводящей к пузырчатому фиброзу ( Zielenski и Tsui, 1995 ). В отсутствии ATP MW Rad50cd-I74R и -S793R обладают молекулярной массой единичного домена дикого типа Rad50cd в 35 кДа. В присутствии ATP Rad50cd-I74R обладает MW в 60 кДа, неотличимую от таковой димера Rad50cd дикого типа. В противоположность этому, Rad50cd-S793R обладает MW в 35 кДа даже в присутствии ATP, что указывает на дефект взаимодействия. Таким образом, экспериментально подтвержденной формой существования димера в растворе является димер с мотивом узнавания Rad50, а не производное димера HisP. Невозможность наблюдения димера с мотивом узнавания в области взаимодействия ABC-ATPазы HisP может являться следствием наличия у HisP участка 6xHis, стерически препятствующего образованию димера с мотивом узнавания Rad50cd.
