Взаимодействие различных TRAF белков с TRADD
Для окончательного выяснения функциональных последствий взаимодействия TRADD-TRAF2 необходимо установить, могут ли другие представители семейства TRAF взаимодействовать с TRADD. По отношению к указанной специфичности существующие экспериментальные данные противоречивы ( Hsu и др., 1996b ; Shu и др., 1996 ).
Возможность исследования кристаллической структуры позволила нам разрешить этот вопрос путем тщательного исследования консервативности последовательностей у различных белков TRAF в районе TRADD-N- связывающего сайта с последующим структурным мутагенезом. Эти "переключающие" мутации, заменяющие остатки TRAF2 на соответсвующие остатки других представителей семейства TRAF были затем оценены с помощью биосенсорных измерений.
Серьезное влияние мутаций TRAF2 T401M, L471K и L471R ( Рис 4В и рис 4С ) позволило установить, что TRAF3 , TRAF4 и TRAF5 обладают значительно меньшей способностью к связыванию с TRADD, чем TRAF2 . Как T401, так и L471 составляют часть области взаимодействия I и полностью скрыты под большей частью гидрофобной поверхностью ( Рис 4А ). Следовательно, больший размер M401 и заряд K/R471 могут привести к созданию нежелательных контактов при взаимодействии. В TRAF6 почти все взаимодействующие с TRADD остатки замещены, включая остатки T401 и L471. В дополнение к этому, мутации D450K и S467F также имели нежелательные последствия при взаимодействии. Предсказываемые аддитивные эффекты этой двойной мутации могут сами по себе приводить к возникновению дельта- дельта-G в 2 ккал/моль, что соответствует 30-кратному уменьшению сродства.
Единственным представителем семейства TRAF, сохраняющим, по-видимому, способность к взаимодействию с TRADD, является TRAF1 , содержащий практически идентичный набор остатков в TRADD-связывающем сайте. Единственная неконсервативная замена S454A приводит к небольшому изменению сродства ( Рис 4B ), даже несмотря на то, что боковая цепь S454 опосредует, по-видимому, взаимодействие с помощью водородных связей TRADD с Q143. С этим согласуется и то, что мутация Q143A TRADD также оказывает минимальное влияние на связывание ( Рис 3B ), вероятно, из-за подвижности области II поверхности взаимодействия. Вклад в увеличение сродства в процессе сборки сигнального комплекса должен был бы в дальнейшем увеличивать специфичность TRADD по отношению к TRAF1 и TRAF2 по сравнению с различием степеней сродства, показанного для одновалентных взаимодействий.
Специфичность TRADD для TRAF1 и TRAF2 объясняет вовлечение cIAP в сигнальный комплекс, которое может быть важным для прямого ингибирования каспазы-8 ( Wang и др., 1998 ) и немедленного подавления апоптоза в верхней точке каскада ( Рис 1D ). Клеточные ингибиторы каспазы cIAP1 и cIAP2 были первоначально выделены из сигнального комплекса TNFR2 и показаны как взаимодействующие с TRAF1 и TRAF2 (Rothe и др., 1995).
Это взаимодействие в значительной степени уникально, поскольку другие ингибиторы белков апоптоза (IAP) не взаимодействуют ни с одним из белков TRAF, а другие белки TRAF не взаимодействуют с cIAP ( Roy и др., 1997 ). Кроме того, это взаимодействие с сIAP обладает той же специфичностью для TRAF1 и TRAF2 ( Rothe и др., 1995 ). Следовательно, подобно TRADD, cIAP обладают той же специфичностью для TRAF1 и TRAF2. Это не соответствует прямому вовлечению TRAF рецепторами подгруппы TNF , не содержащими домен смерти, проявляющему более разнородную специфичность для TRAF1, 2, 3 и 5 ( Park и др., 1999 ; Ye и др., 1999 ). Любопытно, что TRAF1 не содержит аминоконцевого эффекторного домена для сигнала адаптации посредством активации транскрипции генов, тогда как у других белков TRAF, таких, как TRAF5 и TRAF6, он присутствует. Следовательно, включение TRAF1 в сигнальный комплекс TNFR1 подразумевает в дальнейшем важность cIAP для функции антиапоптоза, неотъемлемо присущей TNFR1.
Более высокое сродство взаимодействия TRADD-TRAF2 в противоположность взаимодействиям TRAF2 и рецептора приводит к более эффективному TRADD- опосредованному сигналу TRAF2.
