Мутации TRADD с различным сродством к TRAF2: защита от апоптоза
Используя мутантные TRADD с различными степенями падения сродства к TRAF2 , было проанализировано влияние этих мутаций на обеспечение защиты от апоптоза.
Мы отобрали три точечные мутации TRADD - H65A, Y16A и S67A - с убывающим сродством по отношению к TRAF2 ( Рис 3B ) и протестировали их апоптозоиндуцирующее влияние в экспериментах по трансфекции. Было показано, что трансфекция или сверхэкспрессия TRADD способна индуцировать клеточную смерть в клетках TNFальфа-чувствительных линий, таких, как L929 ( Liou и Liou, 1999 ). Если взаимодействие между TRADD и TRAF2 чувствительно к модуляции сродства, ожидается, что мутантные TRADD с пониженной способностью к взаимодействию с TRAF2 вызовут более сильное проявление клеточной смерти. Экспериментальные данные показали, что мутантные TRADD обладают, конечно, высоким потенциалом индукции апоптоза по сравнению с TRADD дикого типа . Лишь незначительный процент подверженных трансфекции клеток выжили по истечении двух дней после процедуры. Мутанты H65A проявляют лишь 9-кратное снижение уровня сродства к TRAF2, что сходно со степенью сродства при взаимодействии TRAF2 с линейными мотивами рецепторов. Этот мутант обладал, что удивительно, столь же высокой степенью индукции клеточной смерти, как и S67A. Эти данные подтверждают, что взаимодействие in vivo между TRADD и TRAF2 исключительно чувствительно к изменениям сродства. Умеренное падение сродства мономера, могущее выразиться в большем различии во многомерном сродстве, может привести к дисбалансу регуляции между выживанием клетки и клеточной смертью.
Возможны два пути, согласно которым TRAF2 может защищать клетки от апоптоза, и совмещение двух механизмов может являться необходимым для эффективного подавления апоптоза.
Первый механизм предполагает вовлечение ингибиторов клеточной каспазы, cIAP1 и cIAP2 , в сигнальный комплекс TNFR1 с помощью TRAF1 и TRAF2 для ингибирования активации каспазы-8 ( Rothe и др., 1995 ; Wang и др., 1998 ). Этот механизм реализуется в начале опосредуемого TNFальфа апоптоза , является независимым от генной транскрипции и объясняет специфичность взаимодействия TRADD с TRAF1 и TRAF2, но не с другими представителями семейства TRAF.
Второй механизм может иметь отношение к способности TRAF2 активировать JNK и NF-kB , каждый из которых способен индуцировать экспрессию генов антиапоптоза для подавления клеточной смерти ( Beg и Baltimore, 1996 ; Minden и Karin, 1997 ). Поскольку индукция апоптоза может быть быстрой и не требовать транскрипции генов и синтеза белков, первый механизм является, вероятно, решающим при контроле апоптоза, тогда как второй механизм может в дальнейшем усиливать эффект апоптозной функции TRAF2.
