Передача сигнала: роль COPI и ARF-1
В результате недавних исследований [ Goldberg, 2000 ], в которых использовалась система in vitro с очищенными растворимыми компонентами, был разработан новый высокоэффективный подход к дальнейшему определению функций коатомера, транспортируемых веществ и ARF1 в регуляции мембранного транспорта. Полученные им данные предполагают, что ассоциация между COPI и сортирующими последовательностями может сама по себе влиять на динамику связывания, в результате чего достигается направленность транспорта. Осуществляемые с помощью ARF1 циклы связывания и гидролиза ГТФ, лежащие в основе встраивания коатомеров в мембраны, регулируется факторами обмена гуанина ( GEF ), стимулирующих обмен ГДФ на ГТФ; а также белков активирующих ГТФазу ( GAP ), превращающих ARF-ГТФ в ARF-ГДФ. В 1999 году Гольдберг опубликовал кристаллическую структуру ARF-GAP-домена белка ARF-GAP1 в комплексе с ARF1-GDP, показав, что домен GAP контактирует с ARF1 в удаленных от ГТФ-связывающего кармана участках. Это привело его к необходимости исследования того, способны ли такие дополнительные молекулы, как COPI, самостоятельно участвовать в ARF-зависимой реакции, регулируя возврат ARF1в неактивное, ГДФ-связанное состояние. Используя систему in vitro с очищенными компонентами и усеченным немиристоиловым N- концом он обнаружил, что COPI стимулирует ARF-GAP-катализируемый гидролиз ГТФ на ГТФ-связанном ARF1 [ Goldberg, 1999 ]. Это предполагает, что, будучи встроенным в мембрану с помощью ARF1, COPI модулирует активность ARF1, регулируя степень ассоциации ARF1-ГТФ с мембраной и время жизни комплекса.
Последние работы Гольдберга расширили эти представления, показав, что на способность COPI к модуляции активности ARF1 оказывают влияние цитоплазматические мотивы несущей молекулы [ Goldberg, 2000 ]. Он обнаружил, что пептиды, являющиеся производными от цитоплазматического фрагмента определенного белка семейства р24 , а именно р24а , ингибируют стимулируемую коатомером активность ARF-GAP, тогда как пептиды - производные других представителей семейства р24 и дилизиновых последовательностей не оказывали влияния на нее.
Таким образом, взаимодействие со специфическими транспортными рецепторами р24 или двухосновными последовательностями в системе определяет время жизни комплекса ARF-ГТФ и, следовательно, ассоциацию COPI с мембранами (принимая как допущение то, что гидролиз ГТФ на ARF связан с высвобождением COPI). Специфичность данного ответа подтверждается ингибированием COP- стимулируемого GAP посредством р24a (FFEVRRVV), тогда как р24d (FFEAKKLV) не возымел эффекта.
Следовательно, гидролиз ГТФ при взаимодействии COPI с p24a может быть задержан, что позволяет осуществиться формированию оболочки везикулы. Однако, взаимодействие COPI с другими представителями семейства р24 или дилизиновыми мотивами приводит к быстрому гидролизу ARF-связанного ГТФ таким образом, что сборка оболочки не успевает произойти [ Goldberg, 2000 ].
Модель Гольдберга, согласно которой COPI способен регулировать подобным образом сортировочные сигналы для установления времени формирования оболочки, является привлекательной, но требующей дополнительной проверки при более физиологических условиях. Недавно [ Szafer ea., 2000 ] подтвердили результаты Гольдберга, показав, что COPI стимулирует катализируемый ARF-GAP гидролиз ГТФ при усеченной форме ARF1. Однако, они обнаружили, что активность ARF-GAP1 существенно выше, нежели при использовании в данном эксперименте фосфолипидных мицелл и полноразмерного, миристоилового ARF1. Что является более существенным, они показали отсутствие влияния COPI на катализируемый GAP гидролиз ГТФ при данных условиях. Хотя использование фосфолипидных мицелл и миристоилового ARF1в эксперименте Сцафера представляет собою попытку моделирования условий и участка гидролиза ARF-ГТФ (т. е., поверхности мембран Гольджи), липидные мицеллы - не мембраны Гольджи. Расхождение между результатами Гольдберга и Сцафера должно быть разрешено при использовании интактных мембран Гольджи, содержащих ARF-GEF, GAP и белки p24. Принимая во внимание то, что гидролиз ГТФ на ARF необходим для опосредованного COPI избирательного транспорта белков [ Lanoix ea., 1999 ], основные усилия будущих работ будут сконцентрированы в области разработки новых методов (как in vitro, так и in vivo) наблюдения явлений избирательного транспорта в мембранах Гольджи в присутствии повторяющихся циклов нуклеотидного обмена и гидролиза на ARF1.
