Ангиогенин: синтез
Первоначально АНГ был получен из бессывороточной среды, кондиционированной клетками аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29 (т.е. из среды для культивирования, измененной в результате жизнедеятельности указанных клеток) [ Fett J.W. et al., 1985 ]. Далее, кДНК АНГ обнаружили в клонотеке, приготовленной из нормальной печени человека, что свидетельствует об экспрессии гена АНГ в этом органе. Содержание кДНК, однако, было небольшим: лишь 7 из 35000 клонов оказались положительными [ Kurachi К. et al., 1985 ]. Затем АНГ человека был выделен из плазмы и сыворотки крови [ Shapiro R. et al., 1987 ].
С помощью Нозерн-блотинга исследовали распределение мРНК АНГ в тканях крыс на разных стадиях онтогенеза, а также в отдельных линиях трансформированных клеток [ Weiner H.L. et al., 1987 ]. мРНК обнаружена, главным образом, в печени, а также в почках, легких, сердце, тонкой и толстой кишке, коре надпочечников, селезенке, мозге половозрелых крыс.
Денситометрический анализ показал, что содержание мРНК АНГ в печени в 20-100 раз выше, чем в других органах.
Синтез АНГ в печени связан с механизмами онтогенеза. В 10- дневных эмбрионах крыс матрица АНГ не обнаруживается, в печени 15-и 19-дневных плодов он синтезируется в небольших количествах, между 19-м днем внутриутробного развития и 2-м днем постнатальной жизни содержание мРНК АНГ в печени увеличивается в 10 раз, а при достижении половой зрелости отмечается двукратное превышение уровней, обнаруживаемых у новорожденных животных. Содержание мРНК АНГ в клетках НТ-29 и гепатомы SK-HEP , по крайней мере, в 3 раза ниже, чем в печени нормальных половозрелых крыс, однако ее содержание в клетках НТ-29 примерно в 2 раза выше, чем в нормальных клетках толстой кишки [ Weiner H.L. et al., 1987 ].
С позиций логики экспрессия гена АНГ в онтогенезе кажется непонятной. В развивающемся плоде с быстрым ростом сосудов, где следовало бы ожидать усиленную экспрессию генов, кодирующих ангиогенные полипептиды, содержание мРНК АНГ или невелико, или она не обнаруживается вовсе. В тканях же взрослых особей, где новые сосуды растут медленно (время обмена эндотелиальных клеток в органах взрослых мышей составляет приблизительно 100- 3000 дней) [ Hohson В., Denekamp J., 1984 ], мРНК АНГ обнаружена во всех изученных органах, а в особенно большом количестве - в печени [ Weiner H.L. et al., 1987 ]. Однако это противоречие наблюдается не во всех случаях. Синтез мРНК трансформирующего фактора роста крыс (ТФР-альфа) у эмбрионов первой недели внутриутробного развития происходит интенсивно, но вообще не выявляется у 13-дневных эмбрионов [ Lee D.C. et al., 1985 ].
Если активность АНГ регулируется на уровне транскрипции, то описанные этапы экспрессии гена АНГ в онтогенезе могут свидетельствовать о том, что АНГ не необходим для роста сосудов при развитии плода. Если АНГ все же является индуктором роста сосудов, тогда его активность у взрослых особей должна находиться под жестким контролем на посттрансляционном уровне, поскольку в органах взрослых животных, где рост сосудов фактически отсутствует, мРНК АНГ активно синтезируется. Контроль может осуществляться, например, за счет связывания АНГ с плацентарным ингибитором РНКазы [ Shapiro R., Vallee B.L., 1987 ].
Преимущественный синтез АНГ в печени не удивителен, поскольку печень активно регенерирует при повреждении, что сопровождается быстрой пролиферацией сосудистого эндотелия [ Widmann J.J., Fahimi H.D., 1975 ].
При исследовании синтеза АНГ в культурах клеток человека с помощью радиоиммуноанализа белок АНГ определяли в супернатантах клеток, растущих в средах с фетальной сывороткой [ Moenner M. et al., 1994 ]. Секрецию АНГ в монослойных культурах учитывали на стадии, когда клетки находятся в конфлюэнтном состоянии (т. е. в стадии слияния). Оказалось ( табл. 1 ), что фибробласты секретируют гораздо меньше АНГ, чем гладкомышечные и эндотелиальные клетки сосудов. Самый низкий уровень синтеза наблюдали в случае фибробластов подкожной вены ноги (SV-F) : 0.30 + 0.06 нг/106 клеток после 4 дней культивирования. Иммунореактивность супернатантов гладкомышечных клеток аорты и эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) соответственно в 7 и 9 раз выше (2.21 + 0.46 и 2.71 + 0.54 нг/106# клеток после 3 дней культивирования).
Уровень синтеза АНГ в монослоях опухолевых клеток сравним с уровнем в культурах нормальных клеток. Так, в клетках HeLa (опухолевые эпителиальные клетки карциномы шейки матки ) и НТ-29 скорость образования АНГ (2.20 + 0.53 нг/106# клеток за 96 ч и 1.79 + 0.52 нг/106 клеток за 48 ч соответственно) высока, тогда как в клетках А-431 (опухолевые эпителиальные клетки эпидермоидной карциномы ) остается на низком уровне (0.46 + +0.11 нг/106# клеток за 120 ч). В отличие от клеток, растущих в монослойных культурах, нормальные мононуклеарные клетки плазмы человека в суспензионных культурах синтезируют очень небольшое количество АНГ (0.02 + 0.01 нг/106# клеток за 72 ч) [ Moenner M. et al., 1994 ].
Показана корреляция между уровнями секретируемого белка и уровнями мРНК АНГ в клетках, например, в клетках HUVEC , эндотелиальных клетках аорты взрослого быка (АВАЕ) , опухолевых эпителиальных клетках легочной карциномы А549/8 , гибридных клетках эндотелиального происхождения EA.hy 926 , а также в опухолевых клетках Т-клеточного происхождения МТ-4 , секретирующих достаточно большое количество АНГ. В опухолевых клетках миеломоноцитарного происхождения HL-60 и U-937 , которые фактически не секретируют АНГ, мРНК не выявляется [ Moenner M. et al., 1994 ]
мРНК АНГ обнаруживается в клетках с трудом. Белок АНГ секретируется в достаточно большом количестве, что, по-видимому, обусловлено устойчивостью АНГ к протеазам. Из 16 изученных протеаз способностью к расщеплению АНГ обладают только эндопротеаза Lys-C , трипсин и пепсин [ Harper J.W., Vallee B.L., 1988 ].
