Гидролаза амидов ЖК (Амидаза)
Фермент из печени крыс оказался локализованным главным образом в микросомах , хотя и митохондрий проявляли существенную активность [ Schmid, ea 1985 ].
Гидролиз протекал во всем исследованном диапазоне рН - от 5 до 9, активность повышалась с увеличением рН. Фермент оказался весьма специфичным как к основаниям, так и к жирным кислотам, входящим в состав N-ацилэтаноламинов [ Schmid, ea 1985 ]. Амидаза, гидролизующая PEA, была обнаружена также в микросомах мозга собак [ Natarajan, ea 1984 ].
Приведенные выше данные по амидазной активности тканей животных касались исключительно этаноламидов насыщенных и моноеновых жирных кислот. Из производных полиеновых ЖК, как субстрат для амидазы, исследован главным образом ANA . Амидазная активность по отношению к нему была обнаружена в препаратах клеток мозга и других тканей крысы [ Deutsch, ea 1993 ], причем наибольшая активность наблюдалась преимущественно в мембранной фракции. В сердце и мышцах она отсутствовала. Максимальная ферментативная активность наблюдалась между рН 8 и рН 9, а ниже рН 6 и выше рН 10 она значительно снижалась [ Omeir, ea 1995 ]. PMSF оказался сильным ингибитором фермента (IC#50 = 290 нМ [ Deutsch, ea 1997 ]). Его применение повышает активность вытеснения анандамидом радиоактивно меченных каннабимиметиков [ Childers, ea 1994 ] и усиливает ингибирование анандамидом электростимулированного сокращения препарата подвздошной кишки морской свинки [ Pertwee, ea 1995 ]. Трифторметилкетоны и этиловые #-кетоэфиры жирных кислот, в первую очередь арахидонилтрифторметилкетон (IC#50 = 1,9 мкМ [ Deutsch, ea 1997 ]) и этил-2-оксостеарат, также активно ингибировали гидролиз ANA, тогда как #-кетоэтаноламиды и этаноламиды были относительно слабыми ингибиторами [ Koutek, ea 1994 ]. Недавно были синтезированы более активные ингибиторы амидазы - лаурилсульфонилфторид (IC#50 = 3 нМ) [ Deutsch, ea 1997 ] и метиларохидонилфторфосфонат (IC#50 = 2,5 нМ) [ Deutsch, ea 1997 ].
Амидаза демонстрировала специфичность только к амидам жирных кислот, но не гидролизовала пептидную связь и не проявляла церамидазной активности [ Ueda, ea 1995 ]. Амид олеиновой кислоты ( олеамид ) - фактор, индуцирующий сон, - также являлся субстратом [ Maurelli, ea 1995 , Cravatt, ea 1996 ]; в настоящее время этот фермент обозначают как гидролаза амидов ЖК . Исследования на различных типах клеток показали, что существуют различия в субстратной специфичности амидаз в зависимости от типа ткани. Так, амидазы крысиных RBL-1-клеток обнаруживали большую активность по отношению к пальмитоилэтаноламину (К#m = 20 мкМ) по сравнению с анандамидом (К#m = 67 мкМ), тогда как амидазы нервных клеток (N#18TG#2) проявляли противоположную активность (К#m = 80 и 15 мкМ для PEA и ANA соответственно) [ Bisogno, ea 1997 ]. Характерно, что PEA имеет большее сродство к периферическим (СВ2) рецепторам, a ANA - к СВ1 головного мозга [ Раса, ea 1995 ]. Таким образом, амидазная активность представляет собой единый механизм инактивации специфических для разных тканей биологически активных модуляторов - амидированных производных ЖК ( рис. 2 ).
На основании изучения гидролазной и синтетазной активности ферментного препарата из свиного мозга было высказано предположение, что обе активности принадлежат одному белку [ Ueda, ea 1995 ]. Возможно, что при локальном повышении концентрации этаноламина и арахидоновой кислоты создаются необходимые условия для обращения амидазной реакции и синтеза ANA. Однако авторы не исключают и возможности существования специфического механизма активации синтетазной реакции выделенного ими фермента, снижающего требуемые значения К#m [ Ueda, ea 1995 ].
