Аденилосукцинатсинтетаза (6.3.4.4)

Карта белка аденилосукцинатсинтазы

КФ 6.3.4.4  

Рекомендуемое название - аденилосукцинатсинтаза. Другое на звание - сукцино-АМР-синтетаза, IMP-аспартат-лигаза. Систематическое на- звание - IMP:L-ааспартат-лигаза (образующая GDP).

Катализируемая реакция: IMP+ASP+GTP=ADSUC+GDP+Pi

У млекопитающих найдено два тканеспецифичных изофермента аденилсукцинатсинтетазы [ Matsuda Y.,1977 ; Stayton M.M.,1984 ]: кислый изофермент типа L и щелочной изофермент типа М. Кислый изофермент имеет pI 5,9 , а щелочной - pI 8,9 [ Matsuda Y.,1977 ]. Изоферменты характеризуются близкими оптимумами pH в нейтральной области; классификация основана на величинах pI, а не на величинах оптимума pH. У млекопитающих изофермент М резко преобладает в скелетных мышцах и сердечных мышцах ( более 95% от об- щей активности), в клетках языка и в клетках пищевода , почти одинаково количество изоферментов L и М в печени (46 и 54% соответственно), в малой пропорции по отношению к L изофермент М содержится в мозге и почках ( 13-16 и 7-18% от общей активности соответственно), а также в вилочковой железе , и практически отсутствует в селезенке, легких , желудке и тонком кишечнике [ Stayton M.M., 1984 ].

Щелочной изофермент из скелетных мышц крысы [ Ogawa H.,1977 ] и скелетных мыщц кролика [ Muirhead K.M.,1974 ],очищен до гомогенного со- стояния и имеет мол. массу 104 и 54 кДа соответственно. Фермент представ- ляет собою димер, диссоциирующий на идентичные субъединицы с мол. массой 52 кДа; ферментативно активен димер [ Stayton M.M.,1984 ]. Фермент из кро- лика является неспособным к димеризации мономером. Высокоочищенный из печени крысы [ Rudolph F.B.,1982 ] и частично очищенный из гепатомы Новикова [ Clark S.W., 1976 ] кислый изофермент аденилосукцинатсинтетазы является мономером с мол.массой 55-60 кДа. С другой стороны, высокоочи- щенный кислый изофермент из клеток опухоли Иошида [ Matsuda Y.,1980 ] представлял собою димер с мол. массой 102 кДа, состоящий из идентичных субъединиц с мол.массой 47 кДа. Причины невозможности обнаружить в ряде случаев димерные формы щелочного и кислого изофермента не выяснены.

Оба изофермента аденилосукцинатсинтетазы для проявления каталитичес- кой активности нуждаются в Mg(2+) [ Ogawa H.,1977 ; Matsuda Y.,1980 ; Stayton M.M., 1984 ], которые частично можно заменить на Mn(2+), Co(2+), Cu(2+) или Ni(2+) [ Ogawa H.,1977 ; Van der Weyden M.B.,1974 ; Matsuda Y.,1980 ; Stayton M.M.,1984 ]. В присутствии Mg(2+) эти ионны металлов ингибировали оба изофермента из клеток опухоли Иошида [ Matsuda Y.,1980 ; Stayton M.M.,1984 ]. Кислый изофермент в печени крысы для максимальной активности требовал более высокие молярные концентрации ионов двухвалентных металлов, чем это необходимо для образования комплекса с GTP [ Cooper B.F.,1982 ],что объясняется [ Stayton M.M.,1984 ] наличием в ферменте специфического регуляторного центра связывания этих ионов.

Кинетика ферментативной реакции определяется независимым присоеди- нением субстратов прямой и обратной реакций [ Cooper B.F.,1986 ] и обяза- тельным образованием промежуточного связыванного с ферментом фосфорилиро- ванного производного IMP-6-фосфо-IMP [ Bass M.B.,1984 ]. Образование это- го производного происходит путем переноса фосфорильного остатка от треть- его субстрата - GTP на IMP. Этот перенос, а также последующий гидролиз 6-фосфо-IMP с освобождением Pi осуществляется механизмом прямого переноса без инверсии конфигурации фосфорильного остатка GTP [ Webb M.R.,1984 ]. GTP в качестве субстрата можно заменить на dGTP [ Muirhead K.M.,1974 ].

Изоферменты аденилосукцинатсинтетазы отличаются величинами кинетичес- ких параметров [ Matsuda Y.,1977 ].Кислый изофермент характеризуется более высокой величиной Km для IMP, чем щелочной. Кислый изофермент сильнее ингибируется фруктозо-1,6-бисфосфатом [ Matsuda Y.,1977 ]. Предполагается [ Matsuda Y.,1977 ; Stayton M.M.,1984 ; Lowenstein J.M.,1972 ; Lowenstein J.M.,1990 ], что кислый изофермент участвует в биосинтезе АМР de novo, а щелочной изофермент, преобладающий в клетках мышц,катализирует реакции пу- ридиннуклеотидного цикла. Предполагалось также [ Guichert O.M.,1991 ], что щелочной изофермент в мышцах выполняет двойную функцию, участвуя как в пуриннуклеотидном цикле, так и в синтезе АМР de novo.

Аллостерическая регуляция активности аденилосукцинатсинтазы ,предпо- лагавшаяся для бактерий повидимому не имеет места у млекопитающих, в том числе у человека [ Gallant J.,1971 ; Nagy M.,1973 ].Возможность предпола- гавшейся ранее аллостерической регуляции аденилосукцинатсинтетазы концен- трацией GTP,а GMP-синтазы концентрацией ATP [ Малер Г.,1970 ] в настоящее время отрицается в связи с тем, что эти пуриннуклеотиды служат не просто "сигналами",изменяющими активность соответсвующих ферментов, а субстрата- ми, использующимися при фосфорилировании промежуточного фермент-субстрат- ного комплекса на одном из этапов ферментативной реакции. Кроме того, было показано [ Smith C.M.,1976 ; Lowe J.K.,1977 ; Cass C.E.,1977 ], что специфические ингибиторы, уменьшающие количество GTP в раковых клет- ках, несущественно снижали в них содержание ATP. Следовательно, умень- шение содержания GTP в клетке практически не изменяло активности адени- лосукцинатсинтетазы. Повышение содержания ATP и GTP в асцитных клетках рака Эрлиха [ Snyder F.F.,1973 ] не влияло на активность аденилосукци- натсинтетазы и, очевидно, не влияло существенно на уровень этого фермента [ Henderson J.F.,1978 ].

Активности аденилосукцинатсинтетазы и ее антагониста фермента IMP-дегидрогеназы ( КФ 1.1.1.205 ), регулируются изостерически. Интен- сивности потоков IMP на синтез AMP через аденилосукцинат и на синтез GMP через ХМР зависят от кинетических параметров катализируемых этими фермен- тами реакций, от конкретных физиологических условий,определяющих концен- трации в клетке субстратов и продуктов реакций,от концентраций физиологи- ческих ингибиторов этих ферментов и, наконец, от соотношения в клетке изоферментов аденилосукцинатсинтетазы, каждый из которых характризуется своими кинетическими параметрами.

Аденилосукцинатсинтетаза ингибируется субстратом IMP, продуктами: аденилосукцинатом, GDP и Pi, а также AMP,GMP,XMP, фруктозо-1,6-биофосфа- том, сукцинатом [ Stayton M.M.,1984 ]. Для щелочного (мышечного) изо- фермента предполагается [ Stayton M.M.,1984 ], что наиболее важным изо- стерическим регулятором служит его субстрат IMP, высокие, но все еще физиологические концентрации которого ингибируют этот изофермент.

Предполается также [ Ogawa H.,1976 ],что неконкурентное (возможно, аллостерическое) ингибирование этого изофермента фруктозо-1, 6-бифос- фатом синхронизирует в мышце функционирование пуриннуклеотидного цикла и гликолиза, поставлющего энергию для мышечного сокращения.

В культивируемых клетках асцитного рака Эрлиха [ Henderson J.F.,1978 ; Grabtree G.W.,1971 ] высокие концентрации L-аспарагиновой кислоты в среде приводили к увеличению скорости превращения IMP в AMP и уменьшали скорость распада IMP до инозина и гипоксантина. Для культивируемых лимфобластов человека показано [ Hershfild M.S.,1976 ], что добавление аденина в среду приводит к уменьшению скорости синтеза AMP в большей степени, чем синтеза GMP, а добавление в среду гуанина вызывало противоположное действие.Следо- вательно, регуляция активности аденилосукцинатсинтетазы определяется тем, каким путем в клетке образуются пуриннуклеотиды: синтезом in vivo или же "сохраняющим" путем, что указывает на дифференциацию между двумя потоками IMP - на синтез AMP и на синтез GMP [ Hershfild M.S.,1976 ]. Регуляция активности щелочного (мышечного) изофермента аденилосукцинатсинтетазы определяется также способностью фермента связываться с сократимыми белками мышечных волокон [ Manfredi J.P.,1989 ], что может привести к изменению координации функционирования ферментов пуриннуклеотидного цикла,состоящего из аденилосукцинатасинтетазы, аденилосукцинатлиазы ( КФ 4.3.2.2 ), и AMP-дезаминазы , ( КФ 3.5.4.6 )

Активность ферментов пуриннуклеотидного цикла, в том числе мышечного изофермента аденилосукцинатсинтетазы, координированно регулируется энерге- тическим состоянием системы [ Manfredi J.P.,1984 ]: уменьшение отношения концентраций [ATP]/[ADP] приводит в клетке к координированному увеличению активностей этих ферментов путем непосредственного воздействия энергетиче- ского состояния на активность AMP-дезаминазы, что приводит, в свою очередь, к увеличению скорости образования IMP.

Отметим, что в мышцах эукариот регуляция ферментов пуриннуклеотидного цикла, в том числе аденилосукцинатсинтетазы, может определяться образова- нием двух полиферментных комплексов, один из которых состоит из ферментов пути биосинтеза IMP de novo и локализован в цитозоле [ Rowe P.B., 1978 ], а второй - из ферментов пуриннуклеотидного цикла, связанных с сократитель- ными белками мышечных волокон.

Относительно физиологического значения пуриннуклеотидного цикла см. AMP-дезаминаза .

Содержание аденилосукцинатсинтетазы изменяется по мере индивидуально- го развития животного: в печени новорожденной крысы активность аденилосук- цинатсинтетазы очень низка и достигала активности, характерной для печени взрослого животного, через 20-25 дней [ Jackson R.S., 1975 ].

Тканеспецифичная активность фермента не изменялась после частичной гепаеэктомии [ Jackson R.S.,1975 ]. Было показано [ Matsuda Y.,1978 ], что в печени здоровой крысы доля кислого изофермента составляет 60%, а в регенерирующей печени она возрастает до 80% за счет снижения доли щелочно- го изофермента; общая активность фермента при этом не изменялась. Скармли- вание животным корма, содержащего пурины,сдвигало долю изоферментов адени- лосукцинатсинтетазы в печени в пользу кислого изофермента, а высокобелковый корм и голодание в сторону щелочного изофермента [ Bougher B.W., 1980 ]. Введение крысе трииодтиронина приводило к увеличению в печени активности лишь кислого изофермента [ Stayton M.M.,1984 ].

В 16 перевивных гепатомах и в 2 опухолях почки общая активность аде- нилосукцинатсинтетазы повышена в 1,6-3,7 раза; повышение не зависит от скорости роста опухоли [ Jackson R.S.,1975 ]. В перевивных опухолях Уокера [ Clark S.W.,1977 ] и Новикова [ Clark S.W.,1976 ] кинетические характеристики кислого изофермента аденилосукцинатсинтетазы изменены: понижена чувствительность изофермента к ингибированию под действием AMP, повышена величина Кm для L-аспартата и уменьшена Кm для IMP. Из раковых клеток был получен ДНК-подобный фактор [ Matduda Y.,1982 ], который in vitro обратимо модифицировал кислый изофермент аденилосукцинатсинтетазы из тех же раковых клеток, изменяя кинетические характеристики изофермента ( величины Кm для субстратов и величину pI от pI 5,9 до pI 5,0).Предполагается [ Matduda Y., 1982 ],что такая модификация приводит к увеличению эффективности катализа.

Аденилосукцинатсинтетаза рассматривается как возможная мишень для действия противораковых препаратов . Ее активность в злокачественных опухо- лях подавлялась L-аланозином [ Tyagi A.K.,1980 ], антибиотиком ходацидином (N-формил-N-оксиаминоуксусная кислота) [ Clark S.W.,1976 ; Matsuda Y.,1980 ; Stayton M.M., 1984 ] мощным, конкурентным по отношению к L-аспаратату ингибитором фермента, и 6-меркаптопуриннуклеотидом [ Clark S.W.,1976 ; Stayton M.M.,1984 ], связывающимся по двум нуклеотид- связывающим субцентрам в активном центре фермента из асцитных клеток опухоли Новикова. Подробнее см. Ферменты биосинтеза пуриновых нуклеотидов как мишени действия противораковых препаратов .

Ссылки:

Все ссылки