Генетический перенос у цианобактерий
Чтобы начать любые манипуляции с генами, нужно иметь возможность осуществить генетический перенос молекулы ДНК в клетку изучаемого организма. Генетический перенос может быть осуществлен в результате естественных способов передачи ДНК: трансформации , конъюгации и трансдукции . Для цианобактерий к настоящему моменту известны и используются в научных исследованиях первые два способа переноса генетического материала.
Показано, что некоторые цианобактерии способны к естественной трансформации экзогенными молекулами ДНК. Первая цианобактерия, для которой описана генетическая трансформация - одноклеточная цианобактерия Synechococcus sp. PCC 7942 (ранее называлась Anacystis nidulans R2) [ Shestakov S.V., Khyen N.T. 1970 ]. Затем трансформация была описана для штамма одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, [ Grigorieva G., Shestakov S. 1982 ], способного расти в темноте на глюкозе [ Anderson S.L., McIntosh L. 1991 , Rippka R., et al. 1979 ]. Трансформация описана и для одноклеточной цианобактерии Agmenellum quadruplicatum штамм PR-6 [ Stevens S.E., Porter R.D. 1980 ].
Трансформацию можно эффективно провести, используя отдельные кусочки геля из легкоплавкой агарозы, содержащие фрагменты ДНК дикого типа [ Dzelzkalns V.A., Bogorad L. 1988 ]. Эти кусочки агарозы могут быть расплавлены и раскапаны на газон клеток мутанта непосредственно на чашке Петри. В сочетании с известной последовательностью ДНК генома Synechocystis sp. PCC 6803, этот способ трансформации позволяет быстро идентифицировать специфичный рестрикционный фрагмент ДНК, комплементирующий мутацию [ Kufryk G.I., Vermaas W.F.J. 2001 , Vermaas W.F.J. 1998 ]. Было также показано, что продукт открытой рамки считывания slr0197 Synechocystis sp. PCC 6803 требуется для процесса поглощения ДНК [ Yoshihara S., et al. 2000 ].
Почему трансформация возможна только у некоторых одноклеточных цианобактерий, но не у других? Одной из причин может быть наличие в клетках нетрансформируемых цианобактерий экстраклеточных нуклеаз, которые часто встречаются, например, у нитчатых, образующих гетероцисты цианобактерий [ Wolk C.P., Kraus J. 1982 ]. Такие ферменты расщепляют вносимую ДНК. Тонкие механизмы, лежащие в основе естественной генетической трансформации цианобактерий, еще требуют изучения.
Искусственным способом трансформации цианобактерий экзогенной ДНК является электропорация . Она использовалась для трансформации разных видов цианобактерий, но этот способ переноса генетического материала имеет побочное действие: он может сопровождаться слабым мутагенным эффектом [ Bruns B.U., et al. 1989 , Muhlenhoff U., Chauvat F. 1996 ].
Трансдукция не описана для цианобактерий. Несмотря на интенсивные исследования различных цианофагов (вирусов цианобактерий), включая лизогенные штаммы [ Козяков С.Ю. и др. 1972 , Менджуль М.И. и др. 1985 , Hu N.-T., et al. 1981 , Rimon A., Oppenheim A.B. 1975 , Sarma T.A., Kaur B. 1997 ], не было обнаружено ни одного вирусного вектора, способного осуществлять трансдукцию какой-либо цианобактерии.
Коньюгация является на сегодняшний день наиболее общим способом переноса ДНК в цианобактериальную клетку. Этот процесс переноса ДНК осуществляется с помощью плазмиды RP4 и ее производных. Эта плазмида P-группы несовместимости относится к плазмидам широкого круга хозяев. Хотя нет доказательств того, что RP4 может сама реплицироваться в клетках цианобактерий, было показано, что она может мобилизовать плазмиды для переноса в разные цианобактерии, включая морские штаммы [ Koksharova O.A., Wolk C.P. 2002c ].
Как только барьеры внешней мембраны, клеточной стенки и плазмалеммы преодолены, остается еще один барьер на пути стабильной генетической трансформации: деградация переносимой ДНК эндонуклеазами рестрикции, присущими штамму реципиенту. Хотя некоторые штаммы, такие, как, например, Synechococcus sp. PCC 7942 и Nostoc PCC 73102, могут быть лишены таких эндонуклеаз, другие цианобактерии имеют их в большом количестве. Nostoc PCC 7524, например, имеет четыре фермента, которые являются изошизомерами Bsp1286I (G[g/a/t]GC[c/t/a]C), AvaI (CyCGrG), Sau96I (GGnCC) и AsuII (TTCGAA) и пятый фермент, для которого мишенью является rCATGy [ Reaston J., et al. 1982 ]. Для Anabaena PCC 7120 (в последующем тексте Anabaena 7120) было показано, что эффективность коньюгационного переноса уменьшалась как экспоненциальная функция количества незащищенных сайтов [ Cobley J.G., et al. 1993 , Elhai J., Wolk C.P. 1988 , Moser D.P., et al. 1993 ]. Было показано, что единичный неметилированный AvaI сайт уменьшает перенос путем электропорации в сто раз [ Thiel T., Poo H. 1989 ]. Следовательно, эффективность генетического переноса может быть увеличена, и, вероятно, значительно, если удастся идентифицировать эндонуклеазы рестрикции в изучаемом штамме цианобактерии и соответственно метилировать переносимую в данный штамм ДНК.
