Транскрипция цианобактерий: гены-репортеры
Использование генов-репортеров - очень чувствительный метод измерений уровня транскрипции определенного гена [ Fernandez-Pinas F., et al. 2000 , Kunert A., et al. 2000 , van Thor J.J., et al. 1999 , Wolk C.P., et al. 1993 , Wolk C.P. 1996 ]. Этот метод позволяет изучать транскрипцию внутри отдельной бактериальной колонии на чашке Петри [ Cai Y., Wolk C.P. 1997 , Kondo T., et al. 1994 , Schwartz S.H., et al. 1998 , Wolk C.P., et al. 1991 , Zhu J., et al. 2000 ] или даже внутри особого типа клеток в филаменте у нитчатых форм. Например, в исследованиях механизмов, которые определяют местоположение будущей гетероцисты среди вегетативных клеток, важно знать, транскрибируются ли определенные гены во всех клетках или только внутри дифференцирующихся или уже зрелых гетероцист, или только в вегетативных клетках. Такие исследования можно провести с помощью генов luxAB, кодирующих люциферазу [ Black T.A., et al. 1993 , Elhai J., Wolk C.P. 1990 , Fernandez-Pinas F., et al. 2000 , Wolk C.P., et al. 1993 ]; гена gfp , кодирующего зеленый флуоресцирующий белок GFP [ Callahan S.M., Buikema W.J. 2001 , Haselkorn R. 1995 , Xu X., Wolk C.P. 2001 , Yoon H.-S., Golden J.W. 1998 ] и гена lacZ , кодирующего бета-галактозидазу [ Thiel T., et al. 1995 ]. Была продемонстрирована возможность использования генов luxC , luxD и luxE для синтеза субстрата для люциферазы внутри клетки [ Fernandez-Pinas F., Wolk C.P. 1994 ]. Что позволяет предотвратить токсичное воздействие этого субстрата при экзогенном добавлении его к клеткам. Как было замечено выше, экспрессия гена-репортера в реципиенте неопровержимо доказывает сам факт генетического переноса [ Billi D., et al. 2001 , Murry M.A., Wolk C.P. 1991 ]. Если экспрессия с промотора изучаемого гена очень слаба, она может быть усилена, что позволит локализовать экспрессию данного гена. Для этого слабый промотор связывают транскрипционно с геном, кодирующим РНК полимеразу фага Т7 и промотор, узнаваемый этой полимеразой, помещают перед генами luxAB [ Wolk C.P., et al. 1993 ]. Гены luxAB успешно использовались для изучения генной экспрессии в индивидуальных колониях одноклеточной цианобактерии Synechococcus 7942 при изучении генетических механизмов, управляющих биологическими часами цианобактерий ( циркадными ритмами ). Были идентифицированы и изолированы колонии, несущие мутации в генах, контролирующих циркадные ритмы [ Katayama M., et al. 1999 , Kondo T., et al. 1993 , Liu Y., et al. 1995 ]. Если гены luxA и luxB помещали в транспозон, они позволяли идентифицировать транспозиции в последовательностях ДНК, находящихся под контролем промоторов, которые регулируются разными факторами окружающей среды, такими, например, как наличие источников азота, температура или повышенная концентрация соли [ Cai Y., Wolk C.P. 1997 , Schwartz S.H., et al. 1998 , Wolk C.P., et al. 1991 ]. Вторичные мутации, которые приводят к несветящемуся или конститутивно- светящемуся фенотипу, позволяют найти регуляторные гены [ Schwartz S.H., et al. 1998 , Zhu J., et al. 2000 ].
Векторы для изучения регуляции промоторов, сконструированные для Synechocystis [ Kunert A., et al. 2000 ], позволяют сделать транскрибируемую сшивку промоторных последовательностей с генами репортерами luxAB и gfp и стабильно интегрировать такую конструкцию в нейтральный сайт на хромосоме Synechocystis.
Каждый ген-репортер имеет свои преимущества и свои недостатки. Бактериальные гены luxAB имеют высокую чувствительность и низкий фон, но требуют наличия кислорода в среде и довольно дорогой аппаратуры для детекции свечения. Трудно бывает получить и четкое изображение при высокой плотности клеток. Использование LacZ как репортера имеет длинную историю количественных исследований. Однако когда используют этот репортер с флуоресцентной бета-галактозидазой в качестве субстрата для локализации экспрессии гена, клетки должны быть подвергнуты фиксации глютаральдегидом [ Thiel T., et al. 1995 ]. GFP требует наличия кислорода для образования и стабилизации светящегося продукта, его созревание происходит в течение нескольких часов и можно столкнуться с проблемой фотовыцветания. Как и в случае с lacZ, высокая плотность клеток не создает проблемы, но для обоих этих репортеров фон, вызванный естественной флуоресценцией цианобактериальных клеток, ограничивает чувствительность этого экспериментального подхода. Все три типа генов-репортеров работают хорошо; исследователю необходимо только выбрать, какой из них лучше всего использовать в конкретном эксперименте.
В качестве репортеров в цианобактериях используются также ген cat , кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу [ Bauer C.C., Haselkorn R. 1995 , Ferino F., Chauvat F. 1989 , Marraccini P., et al. 1993 , Marraccini P., et al. 1994 ] и ген uidA , кодирующий бета-глюкоронидазу (GUS) [ Casey E.S., Grossman A. 1994 , Dolganov N., Grossman A.R. 1999 ].
