Клетка: деление, клеточный цикл, продолжительность, методы определения
Как определить длину каждой фазы клеточного цикла ? Прежде измеряют продолжительность всего цикла. Для этого в гомогенной популяции культивируемых клеток периодически подсчитывают число клеток и определяют время, необходимое для удвоения их общего числа (вместо подсчета клеток можно учитывать их общую массу).
Для определения фазы S в культуральную среду добавляют меченный тритием тимидин на время более короткое, чем длительность фазы S. Затем клетки исследуют методом радиоавтографии и по наличию зерен серебра определяют долю клеток, включивших радиоактивный изотоп в ДНК.
Длительность фазы М определяют аналогичным образом. Под микроскопом подсчитывают долю клеток, содержащих в данный момент конденсированные хромосомы (полученная величина называется митотический индекс ). Во всех подобных вычислениях обычно используют небольшие поправки, поскольку в непрерывно растущей популяции всегда больше молодых клеток, чем старых (их возраст отсчитывают от последнего клеточного деления). Так как одна старая клетка, разделившись превращается в две молодые, в ранней G{l1}l фазе находится вдвое больше клеток, чем в поздней М фазе .
Для определения длительности фаз G{ l1} l и G{l2}l синхронизируют рост клеток в культуре и определяют промежутки времени между выявленными фазами. Митотические клетки, собранные с поверхности культуральной чашки путем встряхивания, представляют собой синхронную популяцию, которая почти сразу вступает в фазу G{l1}l. Время между сбором клеток и началом массового включения меченого тимидмна в ДНК - это и есть продолжительность фазы G{l1}l. Продолжительность G{l2}l определяют непрямым методом, с использованием асинхронно растущих клеток. Кроме того, продолжительность фазы G{l2}l можно узнать, вычитая длины фаз S, G{l1}l и М из независимо определенного клеточного цикла.
Анализ клеточного цикла можно проводить с использованием флуоресцентного анализатора клеток. Клеточную суспензию пропускают через узкое отверстие со скоростью нескольких тысяч клеток в секунду, и оптические измерения производятся для каждой отдельной клетки, проходящей мимо маленького окошечка. При анализе асинхронной клеточной популяции клетки обрабатывают фиксатором, что приводит к остановке деления и делает клеточные мембраны проницаемыми. Затем клетки обрабатывают красителем, который может флуоресцировать лишь будучи связанным с ДНК. Интенсивность флуоресценции окрашенных таким образом клеток прямо пропорциональна содержанию в них ДНК. Пропуская клетки через анализатор, можно быстро определить относительную яркость флуоресценции большого количества клеток, и тем самым и относительное содержание в них ДНК. Клетки с наименьшим количеством ДНК находятся в фазе G{l1}l, клетки в фазах G{l2}l и М содержат вдвое больше ДНК, а в фазе S - промежуточное количество ДНК ( рис.11-8 ).
