p53 белок: Структура вторичная и третичная
На настоящий момент вторичная и третичная структуры исследованы достаточно подробно для большей части макромолекулы, а именно для ДНК-связывающего и олигомеризационного доменов р53. Относительно N-концевой части молекулы (1-80 а.о.) предполагается, что она формирует большую альфа-спиральную структуру ( Levine, 1993 ). N-концевой домен содержит структуры, ответственные за трансактивационную активность, а также области связывания белков MDM2 и E1B-55kDa аденовируса . Сайт- специфическим мутагенезом было показано, что для этих функций важны не столько кислые аминокислотные остатки, сколько гидрофобные Leu22 и Trp23. Также для связывания in vitro с этими белками требуются гидрофобные остатки Leu14, Phe19 и Trp23, Pro27, соответственно.
Фрагмент 94-312 а.о., содержащий ДНК-связывающий домен белка, был экспрессирован в E.coli и использован для кокристаллизации с фрагментом двуцепочечной ДНК, содержащим консенсус связывания р53, в результате чего был получен комплекс, кристалличесая структура которого была определена с разрешением 2,2 ангстрем ( Cho et al., 1994 ). Комплекс содержал на один фрагмент ДНК 3 единицы белкового мономерного фрагмента, 2 из которых непосредственно взаимодействовали с ДНК.
Вторичная структура ДНК-связывающего домена содержит 9 гидрофобных бета-цепей (S1, S3-S10), соединенных короткими петлями от 5 до 11 а.о., 2 коротких гидрофильных бета-цепи (S2 и S2'), 2 альфа-спиральных участка (H1 и H2), а также 3 больших гидрофильных петли (L1-L3) из 12, 15 и 32 а.о.
Основой третичной структуры ДНК-связывающего домена является гидрофобный кор, сформированный бета-цепями S1, S3-S10, которые последовательно уложены по типу орнамента "греческий ключ" в два антипараллельных бета-слоя ( Cho et al., 1994 ). Эти 2 бета-слоя сложены друг с другом в гидрофобный бета-сэндвич, который служит опорой для LSH-мотива (loop-sheet-helix motif). Две больших петли (L1 и L3) и LSH-мотив, состоящий из S2-S2'- бета-шпильки, С-концевой части бета-цепи S10 и альфа-спирали H2 формируют гидрофильную поверхность белковой глобулы, взаимодействующей с бета-спиралью ДНК. Пространственная структура домена стабилизируется ионом Zn с тетраэдрической координацией, лигандами для которого являются Cys238, Cys242 (петля L3), Cys176 (петля L2) и His179 (альфа-спираль H1 в составе петли L2).
Структурные элементы белковой глобулы ДНК-связывающего домена совпадают с консервативными областями II-V, в частности, петля L1 и примыкающая к ней S2-S2'-бета-шпилька (112-141 а.о.) почти точно соответствуют консервативной области II*. С-конец бета-цепи S10 и альфа-спираль H2 (271-286 а.о.) соответствуют консервативной области V* петли L2 (163-195 а.о.) и L3 (236-251 а.о.), вовлеченные во взаимодействие с Zn, соответственно содержат консервативные области III и IV ( Cho et al., 1994 ).
Структура олигомеризационного домена р53 (319-360 а.о.) была определена методом многомерного ЯМР с точностью для каждого атома до 0,9 ангстрем ( Clore et al., 1994 ). Домен формирует одну бета-цепь (326-334 а.о.) и одну альфа-спираль (337-355 а.о.), разделенные между собой turn-элементом (335-336 а.о.). И альфа- спираль, и бета-цепь участвуют в образовании тетрамерной молекулы р53. Олигомеризационный домен отделен от ДНК- связывающего домена гибким 27-аминокислотным спейсером, вероятно позволяющим некоторую свободу относительного расположения этих доменов ( Clore et al., 1994 ).
Тетрамеризационный домен практически совпадает с минимальным фрагментом р53, обладающим трансформирующим действием ( Shaulian et al., 1992 ) из чего можно допустить, что одной из возможностей р53-опосредованной трансформации по доминантно-негативному типу является образование гетеротетрамеров р53, некомпетентных в отношении специфического ДНК-связывания.
Мышиный р53 имеет два автономных олигомеризационных домена ( Wang et al., 1994 ). Сильный тетрамеризационный домен расположен в области 315-350 и обеспечивает формирование стабильных тетрамеров фрагментами р53: 280-390, 315-360 и 31-350 а.о. Нететрамеризационная олигомеризация характерна для фрагментов р53: 1-320 и 80-320 а.о. и приводит к образованию неустойчивых олигомеров без предпочтения к какой-либо специфической олигомерной форме.
Аминокислотные остатки 319-323 представляют собой главный сигнал ядерной локализации NLS1 ( Addison et al., 1990 , Shaulsky et al., 1991 ). Было показано, что С-конец р53 содержит кластер, состоящий из нескольких NLS и для ядерной локализации р53 in vivo необходимы все три домена, хотя NLS11 и 111 менее эффективны по сравнению с высококонсервативным NLS1.
Около 30 С-концевых, преимущественно основных аминокислотных остатков белка р53 предположительно формируют т.н ингибиторный домен , который, возможно, участвует в регуляции ДНК-связывающей активности р53 на уровне самой макромолекулы ( Clore et al., 1994 , Jeffrey et al., 1995 ), но его вторичная и третичная структуры не исследованы.
