PNA: взаимодействия по дуплексному типу
ПНК , содержащие как пуриновые, так и пиримидиновые основания, способны образовывать комплексы с комплементарными олигонуклеотидами ( Egholm M. ea, 1993 , Wittung P. ea, 1994 ). Эти комплексы имеют стехиометрию 1:1 (одна молекула ПНК - один олигонуклеотид) и возможны в случае как параллельной, так и антипараллельной ориентации ПНК относительно олигонуклеотида. Аналогичные комплексы образуются между комплементарными молекулами ПНК и РНК ( Egholm M. ea, 1993 ), а также между двумя комплементарными молекулами ПНК ( Wittung P. ea, 1994 ).
Для доказательства существования этих комплексов и определения их стехиометрии проводились эксперименты по титрованию ( Demidov V.V. ea, 1994b ). Комплексы ПНК-ДНК (ПНК-РНК, ПНК-ПНК) детектировались с помощью ретардации меченого олигонуклеотида в комплексе с ПНК в агарозном геле или по изменению спектра кругового дихроизма ( Egholm M. ea, 1993 , Wittung P. ea, 1994 ). За исключением лизиновой аминокислоты, которая дает лишь слабый пик на спектре, молекула ПНК не обладает хиральностью, поэтому за образованием комплексов можно следить по изменению спектра олигонуклеотида при добавлении различных количеств ПНК ( Egholm M. ea, 1993 ).
Спектры кругового дихроизма также являются источником информации о вторичной структуре комплексов. Спектры антипараллельных комплексов ПНК-ДНК/ПНК-РНК слабо отличаются от спектров ДНК-ДНК/ДНК-РНК. Это свидетельствует о том, что ПНК-ДНК и ПНК-РНК дуплексы имеют геометрию, сходную с правоспиральными A- и B- формами ДНК ( Egholm M. ea, 1993 ). Кроме того, они обладают присущим спиралям ДНК стэкингом оснований.
Данные по структуре антипараллельных комплексов ПНК-ДНК, полученные с помощью ЯМР -спектроскопии, подтверждают, что нить ДНК в антипараллельном ПНК-ДНК дуплексе имеет В-подобную структуру с характерной для нее С2'-эндо конформацией дезоксирибозы ( Рис. Различные конформации сахара ), а азотистые основания ПНК и ДНК соединены водородными связями , наиболее вероятно, уотсон-криковского типа ( Leijon M. ea, 1994 ) (смотри Рис. Схема водородных связей в РНК(ДНК) . Компьютерная обработка данных по ЯМР - спектроскопии, а также расчеты энергии различных ПНК-ДНК и ПНК-РНК гибридов показали, что большую роль в стабилизации комплексов играют водородные связи, возникающие между отдельными атомами остова ПНК (смотри
Рис. Внутримолекулярные водородные связи в структуре ПНК ) ( Almarsson O. and Bruice T.C., 1993 , Almarsson O. ea, 1993 ). Эти связи возникают в пределах одного звена. Необходимость этих водородных связей для образования структуры подтверждается в эксперименте, где их структура нарушалась путем незначительных замен атомных группировок в остове. Такая измененная молекула ПНК утрачивала способность образовывать стабильные комплексы с ДНК ( Almarsson O. ea, 1993 ).
Спектры кругового дихроизма параллельных комплексов ПНК-ДНК и ПНК-РНК и, соответственно, их структура сильно отличаются от антипараллельных ( Egholm M. ea, 1993 ).
Интересно, что хиральность дуплексов ПНК-ПНК определяется хиральностью присоединенного лизина. ПНК в одноцепочечном состоянии практически не дают сигнала на спектре кругового дихроизма, поэтому вся оптическая активность ПНК-ПНК дуплексов приписывается спиральному стэкингу оснований. Аминокислота не имеет значения, так как замена лизина на фенилаланин или изолейцин не меняла существенно вид спектра. Но направление спирали определяется именно хиральностью аминокислоты. При замене D-лизина на L-лизин спектр кругового дихроизма поменялся на зеркально симметричный. В отсутствие лизина комплексы ПНК- ПНК оптически не активны. Предполагается, что в этом случае образуется рацемическая смесь двух оптических изоформ ( Wittung P. ea, 1994 ).
О стабильности различных комплексов можно судить по их температурам плавления. Стабильность ПНК-ПНК дуплексов оказалась выше, чем стабильность антипараллельных дуплексов ПНК-ДНК, которая в свою очередь выше стабильности ДНК-ДНК дуплексов (см. табл.1). Стабильность параллельных ПНК-ДНК дуплексов ниже, чем антипараллельных, но она не уступает стабильности ДНК-ДНК дуплексов. Такая высокая стабильность дуплексов с участием ПНК приписывается отсутствию отталкивания между двумя нитями из-за отсутствия заряда на остове ПНК. В качестве дополнительного довода приводятся данные о стабильности ДНК в высокой соли. В 1М NaCl дуплексы ДНК-ДНК обладают сопоставимой стабильностью с ПНК- ДНК дуплексами ( Egholm M. ea, 1993 ).
*Таблица 1.
| Температуры плавления(Тпл, *oС) ПНК-ПНК, ПНК-ДНК, ПНК-РНК, ДНК-ДНК, ДНК-РНК дуплексов | |||
|---|---|---|---|
| Последовательность | TGTACGTCACAACTA& | GTAGATCACT$ | AGTGATCTAC$ первой цепи* |
| ПНК-ПНК (параллел.) | нет данных | 67,0 | нет данных |
| ПНК-ПНК (антипар.) | нет данных | 45,5 | нет данных |
| ПНК-РНК (параллел.) | 51,2 | нет данных | нет данных |
| ПНК-РНК (антипар.) | 72,3 | нет данных | нет данных |
| ПНК-ДНК (параллел.) | 56,1 | 38,0 | 38,0 |
| ПНК-ДНК (антипар.) | 69,5 | 51,0 | 49,0 |
| ПНК-РНК (параллел.) | 51,2 | нет данных | нет данных |
| ПНК-РНК (антипар.) | 72,3 | нет данных | нет данных |
| ДНК-ДНК | 53,3 | 33,5 | 33,5 |
| ДНК-РНК | 50,6 | нет данных | нет данных |
*направление олигонуклеотидов 5'-3', направление ПНК N-C & ПНК с карбоксильным окончанием. $ ПНК с присоединенным лизином.
