Saccharomyces cerevisiae: генетические и молекулярные методы исследования
Дрожжи представляют собой гибкую и быструю генетическую систему для изучения клеточных процессов.
При времени клеточной генерации около 90 мин. всего за два дня можно вырастить колонии, содержащие миллионы клеток. К тому же дрожжи можно поддерживать в гаплоидной и диплоидной формах, что резко упрощает их генетический анализ. Как и бактерий, гаплоидные клетки дрожжей можно использовать для получения ауксотрофных мутантов со специфическими требованиями к составу питательной среды. Рецессивные летальные мутации можно поддерживать в культуре гаплоидных клеток в виде условных летальных аллелей (например, температуро-чувствительных мутантов) или в культуре гетерозиготных диплоидных клеток (содержащих и аллель дикого типа и мутацию). Наличие высокоэффективной системы гомологичной рекомбинации у дрожжей позволяет произвольно изменять любую выбранную хромосомную последовательность ДНК. К тому же, можно осуществлять манипуляции с участками хромосом в составе рекомбинантных плазмид, которые стабильно поддерживаются в делящихся клетках дрожжей, благодаря включению в них коротких последовательностей центромеры и ориджина репликации ДНК . В дрожжах стабильно поддерживаются даже линейные плазмиды (минихромосомы), содержащие теломерные повторы по концам.
Явление мозаичности , обусловленной эффектом положения , на модели репортерного гена white дрозофилы сыграло важную роль в изучении эпигенетической регуляции генов, а также генов, влияющих на эту уникальную форму репрессии (см. более детально в главе " Drosophila: эффект положения мозаичного типа и сайленсинг генов "). Открытию и изучению аналогичного явления в области теломер у дрожжей, теломерного эффекта положения (telomere position effect - ТРЕ ) помогло использование в качестве репортерных генов Ura3 и Ade2 ( рис. 4.1 ). В присутствии 5-фтороротовой кислоты (5-fluoroorotic acid, 5-FOA) продукт гена Ura3 превращает ее в 5-фторурацил (5-fluorouracil-5-FU) - ингибитор синтеза ДНК, вызывающий гибель клеток. Однако, при интеграции в область гетерохроматина ген Ura3 оказывается репрессированным в части клеток, и именно эти клетки оказываются способными расти на среде с 5-FOA. Таким образом, определяя эффективность роста на среде с 5-FOA с помощью серийных разведений культуры клеток дрожжей ( рис. 4.1 а), можно количественно измерять степень репрессии репортерного гена в очень широких пределах (например, в 10-1000000-кратных). Более того, мутации, нарушающие ТРЕ, могут быть легко идентифицированы по повышению чувствительности к 5-FOA.
Аналогично, при интеграции гена Ade2 в область гетерохроматина происходит его репрессия, и в клетке накопливается предшественник биосинтеза аденина, окрашивая ее в красный цвет. Существенно, что эпигенетическая природа репрессии Ade2 видна в пределах одиночной колонии генетически идентичных клеток. Ген может быть "включен" в некоторых клетках и "выключен" в остальных. Внешне это проявляется как наличие красных участков на фоне белой колонии или наоборот ( рис. 4.1 б). В отличие от теста с использованием Ura3, селекции против клеток, в которых остался не репрессированным ген Ade2, не происходит, поэтому фенотип клеток с интегрированным в субтеломерный гетерохроматин геном- репортером можно использовать как показатель скорости переключения и наследования эпигенетического состояния. Цветной тест с использованием Ade2 представляет собой удивительную иллюстрацию полустабильной природы репрессированного и дерепрессированного состояний.
Вместе с описанными генетическими подходами к протеазо-дефицитным штаммам, растущим в синхронных и асинхронных крупномасштабных культурах, вполне применимы биохимические методы. В последние годы арсенал доступных средств расширился изощренными методами анализа с помощью микрочипов и белковых сетей, легко охватывающих весь небольшой геном дрожжей. Эти методы позволяют осуществлять полногеномный анализ транскрипции, связывания факторов транскрипции, модификации гистонов и белок-белковых взаимодействий. Такой широкий арсенал изощренных методов позволил ученым исследовать механизмы регуляции формирования гетерохроматина и его физиологическую роль в клетках дрожжей. Однако, прежде чем описать эти открытия, необходимо более детально рассмотреть жизненный цикл дрожжей .
