Открытие de novo метилтрансфераз
Все известные прокариотические цитозиновые ДНК-метилтрансферазы обладают общим набором диагностических белковых мотивов ( Postfai et al., 1989 ). Эти особенности были обнаружены и у поддерживающей ДНК-метилтрансферазы Dnmt1 . Поиски в базах данных по тегам экспрессируемых последовательностей ( EST ) выявили три транскрипта, которые потенциально могли кодировать дополнительные ДНК-метилтрансферазы ( рис. 18.3 ). Один из кандидатов, белок Dnmt2 , обладает миниальной ДНК-метилтрансферазной активностью in vitro и его отсутствие не оказывает никакого заметного влияния на уровни метилирования ДНК. Другие два кандидата, Dnmt3a и Dnmt3b , кодировали родственные каталитически активные полипептиды, которые, в отличие от Dnmt1, in vitro не проявляли никакого предпочтения в отношении метилирования полуметилированной ДНК ( Okano et al., 1998 ). Дизрупция генов, кодирующих Dnmt3a и Dnmt3b у мышей, подтвердила, что эти белки представляют собой недостающие de novo метилтрансферазы ( табл. 18.1 ), поскольку ES-клетки и эмбрионы, лишенные этих белков, были неспособны к метилированию de novo провирусных геномов и повторяющихся элементов ( Okano et al., 1999 ). Более того, мужские и женские зародышевые клетки, лишенные белка Dnmt3a или ассоциированного регуляторного фактора, Dnmt3L, не могли установить отличающиеся паттерны метилирования в импринтированных генах ( табл. 18.1 ) ( Hata et al., 2002 ; Kaneda et al., 2004 ). В то время как инактивация и Dnmt3a, и Dnmt3b приводила к ранней эмбриональной летальности, утрата любого из этих генов вызывала серьезные дефекты, приводящие к постнатальной (Dnmt3a) или эмбриональной (Dnmt3b) летальности. Доказательства аналогичной роли у человека появились с открытием, согласно которому синдром ICF , редкое состояние, характеризующееся иммунодефицитом, центромерной нестабильностью и лицевыми аномалиями, связан с мутациями в гене, кодирующем Dnmt3b ( Ehrlich, 2003 ). Анализ геномной ДНК лимфобластоидных клеток, взятых от больных ICF, показал пониженный уровень метилирования генома, особенно в повторяющихся последовательностях ДНК, ассоциированных с перицентромерными районами хромосом.
