Происхождение и процессирование двутяжевых РНК (dsPHK)
Трансгенные конструкции можно ввести в растительный геном в смысловой или антисмысловой ориентации или в виде инвертированных повторяющихся последовательностей ДНК. Вирусы могут иметь геномы, представленные одно- или двутяжевыми ДНК или РНК. Поэтому dsPHK могут возникать разными путями. В принципе антисмысловые транскрипты могут комплементарно спариваться с информационными РНК-мишенями с образованием двутяжевых РНК. Транскрипция инвертированных повторов ДНК может приводить к образованию шпилечных РНК. Вирусные РНК, кодирующие собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу ( vRdRP ) и реплицирующиеся с образованием двутяжевых интермедиатов РНК, включаются в игру прямо на уровне двутяжевых РНК. Наоборот, смысловые трансгены и ДНК-содержащие вирусы как, например, джеминивирусы , для образования двутяжевых РНК нуждаются в клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразе RDR6 и других генетически идентифицированных факторах ( SDE3 , SGS3 и WEX ; табл. 9.2 ). При образовании субстратов для RDR6 транскрипты или смысловые трансгены и вирусные ДНК должны быть в известном смысле аберрантными, например, без 5'cap или полиаденилатного хвоста ( Meins et al., 2005 ).
Активность DCL , необходимая для процессирования dsPHK с образованием siPHK при PTGS , еще не идентифицирована (DCLX). Анализ dсl1 мутантов с частично утраченными функциями показал, что DCL1 , по-видимому, не вовлечен в эту стадию процессинга. Специфический растительный белок HEN1 метилирует З'-нуклеотид у маленьких РНК, защищая их от уридилирования и последующей деградации ( Li et al., 2005 ). DCL2 участвует в образовании siPHK из некоторых, но не всех, вирусных РНК ( Xie et al., 2004 ).
PTGS и VIGS приводят к образованию двух разных по величине и функциональному значению классов siPHK, состоящих из 21 - 22 нуклеотидов и 24 - 25 - 26 нуклеотидов, соответственно ( Baulcombe, 2004 ). В целом, считается, что 21-членные siPHKs участвуют в расщеплении иРНК , а 24-25-26-членные, называемые гетерохроматиновыми siPHK, вызывают эпигенетические модификации в гомологичных последовательностях ДНК ( TGS ).
Вслед за осуществленным DCL процессингом дуплекс siPHK раскручивается и антисмысловая цепочка взаимодействует с одним из белков из семейства аргонавтов с образованием комплекса индуцированного РНК сайлесинга ( RISC ). RISC, запрограммированный siPHK, может затем эндонуклеолитически гидролизовать мРНК-мишени в одном единственном месте примерно в середине комплементарного комплекса siPHK-мРНК. У животных это расщепление катализируется Ago2 "slicer" (см. главу " RNAi и сборка гетерохроматина "). У Arabidopsis эту функцию в трансгенном PTGS выполняет белок AGO1 ( Baumberger and Baulcombe, 2005 ). Вслед за нуклеолитическим расщеплением отдельный З'-фрагмент мРНК деградируется в направлении от 5' к 3' концу экзонуклеазой AtXRN4 ( Souret et al., 2004 ), а 5'-фрагмент, по-видимому, гидролизуется экзосомой в направлении от 3'- к 5'-концу.
