РНК-интерференция направляет сборку "молчащего" хроматина
Феномен RNAi был впервые открыт у Caenorhabditis elegans , где было найдено, что результатом экспрессии dsRNA является утрата экспрессии гомологичного гена. Вскоре стало очевидным, что эта форма RNAi связана с процессом транскрипционного сайленсинга генов ( TGS ), описанного у растений, и подавлением [quelling] у N. crassa (описывается ниже).
У растений и многоклеточных животных известно, что dsRNA, будучи подвергнута процессингу с помощью машинерии RNAi, дает малые РНК, которые осуществляют модификации ДНК и (или) хроматина на гомологичном хроматине. Наличие у дробянковых дрожжей ортологов основных компонентов пути RNAi, т.е. Argonaute (Ago1) , Dicer (Dcr1) и РНК-зависимой РНК-полимеразы ( Rdp1 ), стимулировало их исследование у этих организмов ( Volpe et al., 2002 ), что привело к значительным успехам в понимании опосредованных RNAi модификаций хроматина и сайленсинга.
Фенотипические последствия утери функции Ago1, Dcr1 или Rdp1 сходны с таковыми у мутантов swi6 . пониженное содержание НЗК9me2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер ( рис. 6.3 b). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискретной величины, происходящие с центромерных внешних повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs ; около 21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe ( Reinhart and Bartel, 2002 ; Cam et al., 2005 ). Эти siRNAs генерируются Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепления двунитчатых дериватов гомологичных некодирующих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts].
Хромодоменный белок Chp1 также оказывается компонентом машинерии RNAi. Chp1 связывается с хроматином НЗК9me2 и необходим для сайленсинга репортерных генов во внешних повторах центромер, но он также требуется и для генерации siRNAs, гомологичных центромерным повторам ( Noma et al., 2004 ), и для нормальных уровней метилирования НЗК9 на центромерных повторах ( Partridge et al., 2002 ; Sadaie et al., 2004 ). Роль Chp1 была далее подтверждена идентификацией эффекторного комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing), который содержит Chp1, Ago1, Tas3 и siRNAs, гомологичные центромерным внешним повторам ( Motamedi et al., 2004 ). Кроме RITS был идентифицирован комплекс, содержащий Rdp1 (RDRC-RNA-directed RNA polymerase complex), который содержит предсказанную РНК-геликазу (Hrr1) и предполагаемую поли(A)полимеразу (Cidl2) . Эти компоненты, по-видимому, также являются важной составной частью процесса RNAi и сборки интактного "молчащего" хроматина на внешних повторах в центромерах ( рис. 6.6 ) ( Motamedi et al., 2004 ).
Наличие независимого от RNAi (и зависимого от Atf1 / Pcr1 ) механизма сайленсинга, действующего в "молчащем" локусе типа спаривания для поддержки гетерохроматина, было обнаружено путем обработки клеток без RNAi ингибитором HDAC трихостатином A ( TSA ). Результатом этого явилась полная утрата "молчащего" хроматина из района mat2-mat3, имитирующая эффект делетирования atf1 или pcr1 у мутантов по RNAi ( Hall et al., 2002 ; Jia et al., 2004 ). Однако, как отмечалось выше, для формирования "молчащего" хроматина в центромерных внешних повторах Atf1 и Per1 не требуются ( Kim et al., 2004 ). Кратковременное воздействие TSA также вызывает утрату сайленсинга в центромерах, приводя к гиперацетилированию гистонов, сопряженных с дефектной функцией центромеры ( Ekwall et al., 1997 ). Хотя это индуцированное TSA "эписостояние" является метастабильным, оно может воспроизводиться в нескольких циклах клеточного деления и даже в мейозе. Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что гетерохроматин трудно установить заново, коль скоро достигается это аномальное гиперацетилированное состояние. Эnи состояния могут также устанавливаться в нарушенном (compromised) локусе mat2-mat3, и они тоже воспроизводятся в мейозе ( Nakayama et al., 2000 ).
