Векторы BAC

Векторные системы, основанные на искусственных хромосомах бактерий - BAC (bacterial artificial chromosome) .

В векторных системах BAC используется ДНК хорошо изученного полового фактора ( F-фактора) E. coli - гигантской плазмиды мужских бактериальных клеток, которые являются донорами бактериальной ДНК при конъюгации с женскими клетками ( рис. II.10 ).

Типичный F-фактор содержит гены oriS , repE , parA и parB . Гены oriS и repE обеспечивают однонаправленную репликацию F- фактора, а гены parA и parB поддерживают число его копий на уровне одной-двух на бактериальную клетку.

Классический вектор BAC (pBAC108L) включает в себя все эти гены, а также ген устойчивости к хлорамфениколу, используемый в качестве селектируемого маркера. Вектор содержит также сегмент ДНК, по которому производится клонирование. В этом сегменте имеется типичный полилинкер, а также два уникальных сайта рестрикции HindIII и BamHI , фланкированные промоторами T7- и Sp6- РНК-полимераз. Эти промоторы могут быть использованы для получения РНК-зондов, необходимых для осуществления "прогулок по хромосомам" , а также прямого секвенирования клонированной ДНК в месте стыковки с вектором. Кроме того, во фрагменте имеется сайт cosN , обеспечивающий расщепление вектора со вставкой в уникальном месте с помощью терминазы фага лямбда без применения ферментов рестрикции. Этот фермент используется бактериофагом для специфического разрезания конкатемеров своей хромосомы при упаковке в фаговые частицы. Для той же цели может быть применен и сайт loxP бактериофага Р1 , который является мишенью для фаговой эндонуклеазы Cre . Эти сайты используются для получения специфических концов клонированной ДНК с целью ее дальнейшего рестрикционного картирования путем введения концевой метки с последующим неполным расщеплением с помощью рестриктаз и электрофоретическим разделением образовавшихся фрагментов.

BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки E. coli с помощью электропорации, причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YAC . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов. При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями.

В отличие от YAC-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, BAC-векторы со вставками, как и традиционные F'- факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает простое повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных минипрепаративными методами. Поскольку рекомбинантные BAC-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что весьма существенно для физического картирования больших геномов методами "снизу вверх" .

Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства BAC, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК.

Ссылки:

Все ссылки