Физические карты высокого разрешения
В попытках построения карт генома человека высокого разрешения
экспериментально реализуются два альтернативных
подхода, получивших
названия картирования сверху вниз (top-down mapping) и картирования снизу
вверх (bottom-up mapping).
При картировании сверху вниз (Рис 2.40 пат) исходным в анализе является препарат
ДНК индивидуальной хромосомы человека.
ДНК разрезается крупнощепящими
рестриктазами (например, Not I) на длинные фрагменты, которые после
разделения электрофорезом в импульсном электрическом поле подвергаются
дальнейшему рестрикционному анализу с другими рестриктазами. В результате
получают макрорестрикционную карту, на которой достаточно полно
представлены все последовательности исследуемой хромосомы или ее части,
однако ее разрешение невысоко. На такой карте очень трудно
локализовать
индивидуальные гены. К тому же каждая индивидуальная карта редко охватывает
протяженные сегменты ДНК (как правило, не более 1-10 м.п.о.).
При
картировании генома человека снизу вверх
(Рис
2.40 пат) на основе препарата суммарной ДНК генома или индивидуальной
хромосомы получают серию случайных клонов
протяженных
последовательностей ДНК (10-1000 т.п.о), часть из которых перекрывается
друг с другом. В качестве вектора для
клонирования в этом случае часто
используют искусственные минихромосомы бактерий (BAC) (bacterial artificial chromosome) или дрожжей
(YAC): минихромосомы дрожжей. Серия частично
перекрывающихся и дополняющих друг друга клонов образует
непрерывную
состыкованную (contiguous) последовательность нуклеотидов ДНК, получившую
название контига (contig).
Правильность полученных контигов
подтверждают гибридизацией in situ (FISH) с одновременной их привязкой
к
определенным участкам исследуемых хромосом. Карты, основанные на
контигах, представляют полную информацию о структуре отдельных сегментов
хромосом и позволяют локализовать отдельные гены. Однако такие карты трудно
применять для реконструкции целых хромосом или протяженных их участков
из-за отсутствия соответствующих клонов в имеющихся клонотеках генов.
Основная проблема, которую приходится решать при использовании обоих
подходов к построению физических карт
высокого разрешения, -
объединение разрозненных фрагментов ДНК в непрерывные последовательности
нуклеотидов. Чаще всего для этого применяют специальные клонированные
фрагменты ДНК, получившие название связующих (linking) клонов. Фрагменты
ДНК из связующих клонов содержат в своих внутренних частях
последовательности нуклеотидов крупнощепящих рестриктаз и, следовательно,
представляют собой места стыковки фрагментов ДНК, используемых на первых
этапах физического картирования. Гибридизацией по Саузерну, при проведении
которой в качестве зондов используют фрагменты ДНК связующих клонов,
определяют фрагменты ДНК физических карт, содержащие последовательности
нуклеотидов окрестностей сайтов рестрикции крупнощепящих рестриктаз. Если
два таких фрагмента найдены, то соответствующий связующий клон
перекрывает оба этих фрагмента и является их частью. Связующие клоны, в
свою очередь, отбирают из клонотек генов с помощью
зондов, которые
представляют собой последовательности нуклеотидов сайтов рестрикции
крупнощепящих рестриктаз.
