Инициация репликации плазмиды ColE1
Репликация плазмиды ColE1 происходит в одном направлении (однонаправленная репликация) с использованием репликативного аппарата клетки-хозяина. Сама по себе плазмида не кодирует ни одного фермента, который требовался бы для ее репликации. Область начала репликации содержит два промотора, один из них обеспечивает синтез РНК-праймера ( РНК II ), необходимого для инициации репликации плазмиды. Синтезированная РНК II, длина которой зависит от типа реплицируемой плазмиды, далее подвергается процессингу с помощью РНКазы H с образованием РНК длиной в 550 нуклеотидов. Эта молекула эффективно используется ДНК-полимеразой I в качестве праймера при синтезе ведущей цепи ДНК. В отсутствие РНКазы H затравкой во время репликации служит 3'-конец РНК II, хотя и с меньшей эффективностью. В клетках, дефектных по РНКазе H и ДНК-полимеразе, инициация репликации ColE1 осуществляется ДНК-полимеразой III с участием РНК II.
Все три механизма инициации репликации плазмиды основаны на уникальном свойстве РНК II образовывать стабильный ДНК-РНК- гибрид в области начала репликации. Действительно, обычные транскрипты освобождаются из транскрипционного комплекса после завершения транскрипции и отделения РНК-полимеразы от матрицы, чего не происходит с РНК II. Анализ мутантов плазмиды, дефектных по репликации и их ревертантов показал, что в стабильном гибриде РНК II с матрицей происходит взаимодействие между G- богатой петлей РНК II, образованной 265 нуклеотидами выше точки инициации репликации (положение -265), и С-богатым участком ДНК, расположенным в окрестностях нуклеотида -20 ( рис. I.48,а ). Обе эти последовательности оказались консервативными у родственных плазмид pMB1 , p15A и KSF1030 .
Взаимодействия между указанными последовательностями, по- видимому, происходят в тот момент, когда РНК-полимераза находится в транскрипционном комплексе и цепи ДНК в окрестностях комплекса расплетены. Равновесие между двумя альтернативными конформациями РНК II является критическим в определении доли молекул РНК, остающейся в ДНК-РНК-гибриде, необходимом для инициации репликации плазмиды. Выбор между двумя альтернативными конформациями РНК II определяется первичной структурой участка, расположенного между нуклеотидами -359 и -380 (последовательность бета) ( рис. I.48,б ). Эта последовательность может взаимодействовать с выше расположенной комплементарной последовательностью альфа (структура альфа-бета) или с гомологичной последовательностью гамма, расположенной ниже (структура бета-гамма). После того как РНК-полимераза транскрибирует первые 200 нуклеотидов, образовавшаяся РНК II формирует временную вторичную структуру, для которой характерно наличие трех доменов типа "стебель-петля" (I, II и III). Удлинение РНК II еще на несколько нуклеотидов приводит к разрушению стебля III и образованию стебля IV, который стабилизируется в результате комплементарных взаимодействий между последовательностями альфа и бета. В течение последующей элонгации РНК II у нее возникают две альтернативные возможности формировать свою вторичную структуру. Выбор в пользу той или иной конформации зависит от того, останется ли последовательность бета связанной с последовательностью альфа или же образует новые контакты с гамма последовательностью. Переход от комплементарных пар альфа-бета к бета-гамма сопровождается сильными изменениями конформации РНК II, которые в конечном счете определяют ее способность служить праймером при репликации плазмиды. Молекулы РНК II в конформации альфа-бета могут образовывать РНК-ДНК- гибрид, служащий субстратом для РНКазы H, а в конформации бета- гамма - нет. Предложенная модель подтверждается тем, что мутации, делающие предпочтительным образование конформации бета-гамма из- за дестабилизации стебля IV, затрудняют функционирование РНК II в качестве праймера и приводят к понижению числа копий плазмиды ColE1 внутри бактериальных клеток. Такие мутантные плазмиды, дефектные по репликации, активизируются в результате супрессорных мутаций, стабилизирующих стебель IV.
Таким образом, инициация репликации плазмиды ColE1 зависит от способности РНК II образовывать РНК-ДНК-гибрид вблизи точки начала репликации (ori), на образование гибрида оказывают влияние вторичная и третичная структуры выше расположенной последовательности нуклеотидов предшественника праймера.
