Структурно-функциональный анализ микроцина B
Мы использовали созданную нами систему мутагенеза структурного гена микроцина для дальнейшего исследования процессов гетероциклизации и связи структуры с функциональной активностью пептида.
Мы поставили перед собой задачу произвести полный мутагенез аминокислотных остатков, составляющих первый двойной гетероцикл - Ser40 и Cys41. ( рис. 15 ). Мы хотели узнать, могут ли какие-то аминокислотные замены компенсировать отсутствие бис-гетероцикла и проверить предыдущие данные о том, что мутации в Ser40 полностью препятствуют образованию зрелого вещества [ 133 ].
Для создания библиотеки мутантов мы проводили ПЦР через всю плазмиду с мутагенными праймерами). Полученные данные представлены в Табл. 1 . Многие мутации сопровождались почти полным исчезновением антибактериальной активности одновременно с существенным (на порядок) понижением продукции по данным ВЭЖХ . Понижения продукции не происходило только в случае самых активных веществ. Для всех проанализированных мутантов активных in vivo удалось детектировать масс-ионы, соответствующие ожидаемым массам веществ. С другой стороны, для проанализированных мутантов из числа полностью потерявших антибактериальную активность ни ВЭЖХ пиков, ни масс-ионов детектировать не удалось.
На основании полученных данных можно сделать несколько выводов.
Во-первых, в целом производство микроцина коррелирует со способностью производящих микроцин клеток ингибировать рост чувствительных штаммов E. сoli.
Во-вторых, существуют аминокислотные замены в обоих положениях цикла (Gly, Ala) которые не снижают уровень продукции и лишь незначительно сказываются на антибактериальной активности. В то же время, не было найдено веществ, которые бы детектировались, и при этом не обладали бы антибактериальной активностью.
Это означает, что наличие двойного гетероцикла в сайте "A" в целом не является необходимым для активности вещества, но явно тем или иным образом сказывается на его продукции (возможно, за счет блокирования комплекса McbBCD синтетазы при N->C направленном внедрении гетероциклов). Наши данные находятся в противоречии с ранее опубликованными данными [ 133 ]. Авторы этой работы (Sinha Roy et al.) не смогли получить in vivo вещество с аминокислотной заменой Ser40->Gly и сделали вывод о том, что любая мутация в данном аминокислотном остатке полностью препятствует созреванию вещества. В нашем исследовании показано, что это не так: вещество Ser40->Gly образует пик на ВЭЖХ, детектируется масс-спектрометрически и, будучи выделенным в чистом виде, обладает антибактериальной активностью. Наша способность детектировать вещества со сформированным тиазольным гетероциклом при практически любых вариантах (кроме отрицательно заряженных) аминокислотных остатков на месте Ser40 говорит о достаточно широкой субстратной специфичности микроцин-синтетазного комплекса McbBCD т.к. пептидная связь вышестоящей аминокислоты участвует в образовании гетероцикла, и получается, что даже при обширных боковых цепях вышестоящей аминокислоты (Trp, Leu), этот процесс оказывается возможным.
Далее мы проводили тотальный случайный мутагенез аминокислотных остатков, составляющих двойной гетероцикл "В"-Cys55 и Ser56. ( рис. 15 ). Мы хотели узнать, могут ли какие-то аминокислотные замены компенсировать отсутствие бис-гетероцикла и проверить предыдущие данные о значимости бис-гетероцикла сайта "В" для антибактериальной активности вещества [ 133 , 144 ]. Схема получения мутантов использовалась та же, что и для сайта "A" . Все мутанты, обладающие антибактериальной активностью, и ряд мутантов, полностью потерявших активность, были выделены и охарактеризованы с помощью MALDI . Полученные в ходе мутагенеза данные представлены в Табл. 1 . В первом положении гетероцикла, все мутации, кроме сохраняющей гетероцикл (т.е. Cys на Ser) сопровождались полным исчезновением антибактериальной активности. При этом некоторые мутанты были успешно выделены и их продукция была не намного ниже продукции дикого микроцина по данным ВЭЖХ. Для этих веществ удалось детектировать масс-ионы, соответствующие ожидаемым массам. Во втором положении цикла ,помимо сохраняющей гетероцикл мутации Ser55 на Cys, мутации Ser55->Asn и Ser55->Gly позволяли веществам сохранить частичную антибактериальную активность. Эти вещества также удалось выделить и найти масс-ионы, соответствующие ожидаемым массам веществ с помощью MALDI анализа. Таким образом, в отличие от сайта "A", в сайте "В" производство микроцина не строго связано со способностью производящих микроцин клеток ингибировать рост чувствительных штаммов E. сoli. Следовательно, именно сайт "В" является возможной детерминантой связывания антибиотика с мишенью и это подтверждает ранее высказанные предположения [ 144 ].
Для дальнейшего функционального анализа микроцина, мы получили набор укороченных с С-конца пептидов. Таким образом, мы планировали установить минимальный фрагмент микроцина, способный входить в клетку и ингибировать ДНК-гиразу . Для создания каждого мутанта мы проводили ПЦР с мутагенными праймерами, амплифицируя всю плазмиду pUC-mcbA . Всего было получено 9 мутантов ( Рис. 25 ).
Минимальный фрагмент микроцина, который удалось получить таким образом, содержал 6 гетероциклов (McB 1-59). Более короткие фрагменты не детектировались на хроматограмме и масс-спектрометрически. У всех протестированных веществ за исключением варианта 1-68 антибактериальная активность in vivo практически отсутствовала; у мутанта 1-68 антибактериальная активность детектировалась, но была снижена по сравнению с исходным веществом. Потеря антибактериальной активности могла быть связана с нарушением способности мутантов проникать внутрь клеток через специфичный транспортер SbmA . Для проверки этого предположения оценивалась способность микроцинов ингибировать репликацию ДНК по включению радиоактивной метки в пермеабилизованных клетках E. coli. Результаты этого опыта приведены на рис. 26 . Единственным укороченным вариантом микроцина, способным ингибировать репликацию ДНК наравне с исходным веществом, является самый длинный вариант 1-68. Таким образом, отсутствие антибактериальной активности у большинства укороченных вариантов микроцина является следствием нарушения способности мутантов ингибировать ДНК-гиразу. При этом снижение антибактериальной активности мутанта 1-68 in vivo является доказательством того, что последняя аминокислота микроцина необходима для попадания вещества в клетки.
