Ung и UNG урацил-ДНК-гликозилазы : пространственная структура
В 1995 г. методом рентгеноструктурного анализа были определены структуры hUNG [ Mol, ea 1995 ] и UNG из HSV-1 [ Savva, ea 1995 ] в свободном состоянии. Впоследствии были установлены структуры про- и эукариотических урацил-ДНК-гликозилаз (как дикого типа, так и мутантных форм) из многих эукариотических, прокариотических и вирусных источников как в свободном состоянии, так и в комплексе с Ura, dUrd, различными одно- и двуцепочечными ОДН, а также белком Ugi [ Parikh, ea 1998 , Mol, ea 1995 , Werner, ea 2000 , Bianchet, ea 2003 , Parikh, ea 2000 ].
Общая структура всех этих белков и механизм их взаимодействия с ДНК очень близки, и можно считать Ung/UNG единой системой ДНК-гликозилаз, наиболее хорошо изученной со структурной точки зрения. Поэтому имеет смысл рассмотреть основные известные к настоящему времени закономерности строения ДНК-гликозилаз и их взаимодействия с субстратами на примерах ферментов Ung/UNG и затем использовать их для сравнения при рассмотрении других гликозилаз.
Общую организацию белков Ung/UNG можно представить в виде 4 b- складок, зажатых между 2 a-спиралями с каждой стороны ( рис. 5А ). На поверхности белковой глобулы имеется неглубокая и узкая положительно заряженная бороздка, в которой связывается субстратная ДНК. В этой бороздке находится активный центр фермента, в котором можно выделить глубокий карман, где связывается поврежденное основание ( рис. 6 ). В белке нет ярко выраженных доменов, однако при связывании hUNG с ДНК- субстратом конформация полипептидной цепи белка претерпевает небольшое, но хорошо определяемое изменение: три части белка поворачиваются друг относительно друга примерно на 10* вокруг шарнирных областей, расположенных в районе остатков Asp145-Pro168 и Leu192-Asn215. Эти гибкие области белка пространственно сближены и образуют активный центр фермента; в них находятся и остатки, которые непосредственно участвуют в связывании и узнавании Ura. Гораздо более выраженные конформационные изменения происходят при комплексообразовании в молекуле субстратной ДНК. Структура Ura-содержащей ДНК в свободном состоянии практически не отличается от структуры канонической ДНК. В то же время ось двуцепочечной ДНК, связанной с hUNG, изломана в месте повреждения под углом ~45*, но за пределами поврежденного и противоположного ему звеньев параметры ДНК соответствуют канонической B-форме. Поврежденное звено dUrd больше не образует стэкинг-взаимодействий с соседними и вывернуто из двойной спирали ДНК так, что основание Ura находится к кармане в активном центре фермента. Выворачивание идет в основном за счет изменения торсионных углов a и зета поврежденного дезоксинуклеотида и сопровождается сжатием сахарофосфатного остова ДНК в области повреждения, в ходе которого расстояние между фосфатными группами двух соседних с поврежденным dNMP-звеньев ( p+1-p-1 , рис. 6В ) уменьшается с ~13A в B-ДНК до ~8A. Белок связывается с ДНК со стороны ее малой бороздки, и в межцепочечную полость, образовавшуюся при выворачивании поврежденного дезоксинуклеотида, внедряется боковая группа гидрофобного остатка Leu272. Интеркаляция этого остатка частично восстанавливает стэкинг-взаимодействия за счет образования обширных ван-дер-ваальсовы контактов с азотистыми основаниями, соседними с поврежденным. Водородные связи между молекулой белка и ДНК преимущественно образуются с поврежденной цепью ДНК ( рис. 6В ).
В структурах всех белков Ung/UNG можно выделить 5 основных консервативных структурных мотивов:
1) петля, активирующая молекулу воды (144GQDPYH148 в hUNG);
2) петля, принимающая участие в сжатии сахарофосфатного остова с 5'- стороны от поврежденного звена ДНК (165PPPPS169),
3) мотив связывания Ura (199GVLLLN204),
4) петля, принимающая участие в сжатии сахарофосфатного остова с 3'- стороны от поврежденного звена (246GS247),
5) петля, внедряющая в малую бороздку ДНК (268HPSPLS273). Для связывания UNG с ДНК критическое значение имеют жесткие петли 2, 4 и 5, богатые остатками Ser, Pro и Gly, которые позволяют полипептидной цепи близко подойти к остову ДНК. Петли 2 и 4 сжимают остов и инициируют излом ДНК, который достигает своего максимума после внедрения петли 5 в малую бороздку и выворачивания звена dUrd в активный центр фермента [ Parikh, ea 1998 , Werner, ea 2000 , Jiang, ea 2002 , Wong, ea 2002 ].
Высококонсервативный центр связывания поврежденного основания по форме и электростатическому потенциалу комплементарен Ura, вывернутому из двуцепочечной ДНК, но слишком мал для связывания пуриновых оснований. Наилучшая комплементарность Ura обеспечивается лишь после его выщепления, что вносит вклад в снижение энергии комплекса фермент-продукт относительно комплекса фермент-субстрат.
Структура hUNG в комплексе с ДНК, содержащей звено дезоксипсевдоуридина, показывает, что в комплексе фермент-субстрат конформация расщепляемого дезоксинуклеотида сильно напряжена, причем отклонение связи C1'- N1 от плоскости кольца Ura составляет ~50* [ Parikh, ea 2000 ].
Дискриминация Thy и других пиримидинов, замещенных по положению 5 гетероцикла, осуществляется за счет боковой группы остатка Tyr (Tyr147 в hUNG), образующей с атомом C5 ван-дер-ваальсовы контакты, а дискриминация Cyt - за счет набора специфических водородных связей с атомами O2, N3 и O4. Первый из них образует водородную связь с амидной группой остатка Gln в консервативной последовательности 143GQ144. Амид боковой группы консервативного остатка Asn204, жестко зафиксированный взаимодействием с кластером молекул воды у входа в урацилсвязывающий карман, образует с атомами N3 и O4 специфичные для Ura водородные связи, которые не возникают в случае основания Cyt в активном центре. Критически важная роль комплементарности Ura и центра его связывания в белке была подтверждена разработкой мутантных форм UNG с набором связей для взаимодействия с Cyt или Thy вместо Ura. Получившиеся ферменты были способны удалять нормальные пиримидиновые основания из ДНК и за счет этого сообщать спонтанный мутагенный фенотип клеткам E.coli при гетерологичной экспрессии [ Kavli, ea 1996 ].
