UNG (Урацил-ДНК-гликозилаза): суперсемейство

Открытие дезаминирования Cyt в составе ДНК послужило толчком к поиску ферментов, способных удалять из ДНК основания Ura. В 1974г. Т. Линдал выделил из E.coli "урацилгликозидазу" - активность, способную выщеплять [3H]Ura из ДНК-субстратов, оставляя в ДНК AP-сайты [ Lindahl, ea 1974 ]. Впоследствии этот фермент - первый из всех обнаруженных ферментов, удаляющих поврежденные основания из ДНК - получил название Ung (урацил-ДНК-N-гликозилазы) (uracil-DNA N-glycosylase, Ung). Белок человека UNG с такой же активностью был вскоре выделен из нескольких тканей и типов клеток [ Krokan, ea 1981 ], что позволило секвенировать и клонировать ген ung человека [ Olsen, ea 1989 ]. Консервативные последовательности урацил-ДНК-гликозилазы обнаружены практически во всех про- и эукариотических организмах, а также в некоторых вирусах ( поксвирусы , герпесвирусы ), что свидетельствует о важности этого фермента и сходстве механизма его действия во всех живых системах [ Aravind, ea 2000 ].

См. Ung ген E.coli , Ung ген человека .

Ung специфически выщепляет основания Ura как из одно-, так и из двуцепочечной ДНК, с некоторым предпочтением первой как субстрата [ Lindahl, ea 1977 ]. Однако фермент не способен эффективно удалять Ura из одноцепочечных петель, а эффективность использования одноцепочечной ДНК может модулироваться в присутствии связывающего ее белка Ssb [ Kumar, ea 1997 ]. Ung не проявляет активности по отношению к Thy и Cyt в составе ДНК, и к Ura в составе РНК [ Lindahl, ea 1977 ]. Минимальным субстратом фермента служит dUrd, однако активность Ung по отношению к Ura-содержащим субстратам значительно повышается при наличии фосфатных групп с 5'- и с 3'-стороны от поврежденного звена; pd(UN)p или dAp(UAA) расщепляются ферментом практически с такой же эффективностью, что и более длинные субстраты [ Jiang, ea 2001 ].

Специфические контакты с фосфатными группами также наблюдаются в структуре белка hUNG в комплексе с ДНК (см. разд. UNG ). Способность Ung узнавать Ura в составе как одно-, так и двуцепочечной ДНК отличает этот фермент от подавляющего большинства других ДНК-гликозилаз, активных только по отношению к двуцепочечной ДНК. Активность hUNG, в особенности по отношению к одноцепочечной ДНК, стимулируется физиологическими концентрациями Mg2+ [ Kavli, ea 2002 ].

Наиболее примечательной чертой Ung можно назвать его способность выщеплять основания Ura при полном отсутствии активности по отношению к основанию Thy, отличающемуся только наличием метильной группы при атоме C5 пиримидинового гетероцикла. Фермент также способен выщеплять из ДНК 5-фторурацил , но с гораздо меньшей скоростью, чем основания Ura [ Warner, ea 1980 ]; 5-фторурацил используется в медицине как противоопухолевый агент [ Регистр 2005 ], и не исключено, что на его фармакодинамику может оказывать влияние фермент hUNG. При анализе методом газовой хроматографии с масс- спектрометрической детекцией ( ГХМС ) было также показано, что фермент hUNG узнает производные Ura ( 5-OH-Ura , изодиалуровую кислоту и аллоксан ), образующиеся при гамма-облучении аэрированных водных растворов ДНК за счет окислительного повреждения оснований Cyt [ Dizdaroglu, ea 1996 ]. Другие образующиеся в этих условиях поврежденные основания, детектируемые методом ГХМС, ферментом не узнаются. Ung также выщепляет 5-OH-Ura из ОДН-субстратов [ Hatahet, ea 1994 ]. Все эти окисленные субстраты выщепляются медленнее, чем Ura, однако относительная эффективность разных субстратных оснований в одном и том же контексте и в одних и тех же условиях не сравнивалась. Тем не менее, участие Ung в репарации продуктов окислительного повреждения ДНК не исключено.

Фермент Ung ингибируется свободным основанием Ura , а также его производными 6-аминоурацилом и 5-азаурацилом , слабо ингибируется 5- фторурацилом и не ингибируется 5-бромурацилом, Thy и многими производными Ura, модифицированными по положениям 1-4 пиримидинового гетероцикла [ Krokan, ea 1981 ]. Это, а также способность Ung/UNG выщеплять остатки изодиалуровой кислоты указывает на достаточно высокую толерантность фермента по отношению к заменам в положениях 5 и 6 субстратного основания и на то, что планарность гетероцикла не обязательна для узнавания. Пространственная структура активного центра фермента в целом согласуется со специфичностью к Ura по сравнению к Thy (см. разд. UNG ), но механизм узнавания других субстратов не вполне ясен.

Эффективность выщепления Ura из ДНК ферментами Ung/UNG также зависит от контекста - последовательности ДНК, окружающей поврежденное звено, и основания, расположенного непосредственно напротив него в двуцепочечной ДНК. Поскольку дезаминирование Cyt, в отличие от включения dUMP напротив Ade при репликации, ведет к мутации, можно было бы ожидать, что предпочтительным субстратом для Ung/UNG будет пара Ura:Gua. Однако в литературе имеются сообщения о преимущественном выщеплении Ura ферментом и из пар Ura:Ade [ Eftedal, ea 1993 ], и из пар Ura:Gua [ Bennett, ea 1995 , Slupphaug, ea 1995 ]. Также сообщалось о том, что в зависимости от окружения поврежденное звено последовательности ДНК активность Ung/UNG может варьировать в пределах 10-15 раз [ Eftedal, ea 1993 , Slupphaug, ea 1995 , Nilsen, ea 1995 ]. В целом окружающая последовательность влияет на эффективность выщепления Ura из двуцепочечной ДНК больше, чем основание напротив поврежденного, что может объяснить расхождения в литературных данных по поводу оптимальных субстратных пар оснований. В случае одноцепочечной ДНК консенсусных последовательностей для эффективного действия Ung/UNG обнаружить не удалось, что позволяет предположить важность локального расплавления двуцепочечной ДНК для работы фермента [ Slupphaug, ea 1995 ]. Низкая эффективность удаления Ura из определенных последовательностей ДНК коррелирует с частотой возникновения в них мутаций, что свидетельствует о биологической значимости контекстной вариабельности активности Ung [ Nilsen, ea 1995 ].

Из всех известных ДНК-гликозилаз Ung обладает наивысшей активностью - число оборотов фермента составляет около 800 мин-1 [ Lindahl, ea 1977 ]. Тем не менее, даже этот фермент ингибируется продуктом реакции - ДНК, содержащей AP-сайт [ Parikh, ea 1998 ]. Для других ДНК-гликозилаз эта проблема стоит еще острее; некоторые из них ( MutY , TDG ) в отсутствие вспомогательных белковых факторов осуществляют только один оборот и остаются связанными с субстратом на время, измеряемое часами [ Zharkov, ea 1998 , Porello, ea 1998 , Waters, ea 1999 ]. Однако в мультикомпонентной системе ЭРО активность ДНК-гликозилаз резко повышается за счет их вытеснения AP-эндонуклеазами из комплекса с продуктом; это явление было впервые показано для UNG [ Parikh, ea 1998 ]. Сообщалось о том, что основные компоненты ЭРО для Ura организованы в комплексы, содержащие все необходимые белки [ Akbari, ea 2004 ]; возможно, что скорости реакций всех ферментов ЭРО оптимизированы для максимального ускорения общего процесса, а не его отдельных стадий. UNG связывается с белками репликации PCNA и RPA [ Nagelhus, ea 1997 , Otterlei, ea 1999 ] и, возможно, участвует в репарации включившихся при репликации звеньев dUMP непосредственно в репликативной вилке . Белок UNG фосфорилируется по остаткам Thr6 и Thr126 in vivo при УФ-облучении клеток неустановленной протеинкиназой, что приводит к повышению его активности, и дефосфорилируется p53 -индуцируемой фосфатазой PPM1D , которая ингибирует процесс ЭРО [ Lu, ea 2004 ].

У мутантов E.coli, дефицитных по гену ung, наблюдается повышенная частота мутагенеза, в основном представленного транзициями G-A , что свидетельствует о дезаминировании Cyt как главном источнике Ura в ДНК [ Duncan, ea 1982 ]. В принципе E.coli сохраняет ограниченную жизнеспособность при замене до 95% оснований Thy на основания Ura в геноме [ el-Hajj, ea 1982 ]. Однако рост таких бактерий прекращается после 1-2 делений, что свидетельствует о том, что образование Ura канонических уотсон- криковских пар с Ade недостаточно для корректного функционирования ДНК в потоке генетической информации. У трансгенных мышей с обеими инактивированными копиями гена ung (ung-/-) частота мутаций G-A возрастает лишь незначительно. Такие животные фертильны и не показывают заметных патологий развития. В то же время снижена способность клеток ung-/- удалять из ДНК Ura, включенный в виде dUMP при синтезе, и они содержат около 2000 оснований Ura на диплоидный геном [ Nilsen, ea 2000 ]. В раннем возрасте мыши ung-/- не подвержены спонтанному развитию опухолей или других патологий, однако после 18 месяцев их смертность выше, чем у контрольных животных, что сопровождается патологическими изменениями лимфоидных органов, аномальной пролиферацией лимфоцитов и значительным повышением частоты развития B-клеточных лимфом [ Nilsen, ea 2003 ]. Таким образом, трансгенные мыши, дефицитные по гену ung, представляют собой первую известную модель спонтанного развития злокачественных новообразований в результате дефекта гена ДНК-гликозилазы. Эти данные подчеркивают роль UNG в функционировании B-лимфоцитов в иммунной системе. Тем не менее, риск развития других злокачественных новообразований у мышей ung-/- повышен незначительно, и не исключено, что основная роль в предохранении клеток млекопитающих от мутагенного действия Ura принадлежит ферменту SMUG1 [ Nilsen, ea 2001 ]. Недавно была обнаружена ключевая роль UNG в иммунной системе млекопитающих в процессе соматического гипермутагенеза генов иммуноглобулинов [ Di ea 2007 ].

Ссылки: