Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК
Основания Ura в норме входят в состав РНК, но не ДНК, в которой в качестве основания, комплементарного Ade, присутствует Thy. Однако Ura может возникать в ДНК при спонтанном дезаминировании оснований Cyt [ Василенко ea 2003 ]. В двуцепочечной ДНК дезаминирование Cyt проходит главным образом при атаке молекулой H2O по атому C4 протонированного основания с последующим отщеплением NH4+ [ Shapiro, ea 1966 ]. В одноцепочечных участках ДНК возможно присоединение молекулы H2O по двойной связи C5-C6, что облегчает последующую атаку второй молекулой H2O по атому C4 с образованием промежуточных продуктов 5-гидро-6- гидроксицитозина и 5-гидро-6-гидроксиурацила. Экстраполированная до 37*C (pH7,4) константа скорости гидролитического дезаминирования Cyt в одноцепочечной ДНК составляет ~2*10-10с-1, а в двуцепочечной примерно на 2 порядка меньше [ Lindahl, ea 1974 , Frederico, ea 1990 ]; по оценкам, в ДНК каждой клетки человека ежедневно образуется ~100 оснований Ura только за счет дезаминирования двуцепочечной ДНК [ Frederico, ea 1990 ], а процессы репликации, рекомбинации и транскрипции, сопровождающиеся образованием протяженных одноцепочечных участков, могут значительно увеличивать это число. Спонтанное дезаминирование Cyt ускоряется при возникновении в структуре ДНК элементов, частично индуцирующих ее локальное плавление: Cyt-содержащих циклобутановых пиримидиновых димеров (ЦПД), встраивании интеркалирующих агентов, образовании гетеродуплексов с каноническими или алкилированными основаниями и т.п. [ Lindahl, ea 1993 ]. Помимо спонтанного процесса, Cyt может подвергаться дезаминированию при обработке ДНК такими агентами, как HNO2 [ Schuster, ea 1960 ] (как в одно-, так и в двуцепочечной ДНК) или HSO3- (исключительно в одноцепочечной ДНК) [ Hayatsu, ea 1976 ].
Открыто регулируемое ферментативное дезаминирование Cyt в отдельных участках ДНК человека AID цитозиндезаминазой и APOBEC цитозиндезаминазой [ Bhagwat, ea 2004 ].
Еще один важный путь появления Ura в ДНК - его включение при репликации ДНК из небольшой постоянно существующей фракции dUTP. Основная репликативная ДНК-полимераза бактерий, ДНК-полимераза III (и, вероятно, ДНК-полимераза дельта , основная репликативная полимераза эукариот), использует dUTP и TTP практически с равной эффективностью [ Shlomai, ea 1978 ], поэтому количество включенного dUMP определяется только концентрацией dUTP. В норме подавляющее большинство включенного Ura выщепляется урацил-ДНК-гликозилазой (см. UNG ), что вызывает временную фрагментацию дочерних цепей ДНК при репликации [ Wist, ea 1978 ]; исследование штаммов E.coli ung показывает, что 1 молекула dUMP включается на 2-3 тысячи нуклеотидов [ Tye, ea 1978 ]. Количество dUTP в клетке регулируется скоростью образования dUTP в ходе биосинтеза пиримидиновых dNTP и скоростью его гидролиза dUTP-пирофосфатазой Dut E.coli , dUTP-пирофосфатазой DUT человека ). ДНК штаммов E.coli dut ung может содержать до 0,5% dUMP [ Tye, ea 1978 ]. Ингибирование дигидрофолатредуктазы такими лекарственными средствами, как метотрексат или триметоприм , также приводит к резкому увеличению уровня dUTP и включения dUMP в ДНК за счет снижения уровня тетрагидрофолата и соответствующего снижения эффективности действия тимидилатсинтазы , использующей N5,N10-метилентетрагидрофолат в качестве кофактора при синтезе TMP из dUMP [ Myers, ea 1975 ]. Аналогичное действие в клетках человека оказывает дефицит фолиевой кислоты [ Ames, ea 1999 ].
В отсутствие репарации дезаминирование Cyt должно вести к включению dAMP напротив dUMP в ДНК-матрице в следующем акте репликации и в конечном итоге к возникновению транзиции C-T. Действительно, в штаммах E.coli или линиях клеток человека, дефицитных по системам репарации Ura в ДНК, наблюдается повышение уровня спонтанного мутагенеза с преимущественным появлением именно таких мутаций [ Duncan, ea 1980 , Radany, ea 2000 ]. Включение Ura при репликации не ведет к мутации, но способно нарушать регуляцию экспрессии генов: например, введение Ura вместо Thy снижает связывание регуляторных белков с последовательностью CRE [ Verri, ea 1990 ]. Удаление Ura в процессе репарации приводит к образованию AP-сайтов , которые, в свою очередь, также оказывают мутагенное и цитотоксическое действие (см. AP-сайты ).
Важную роль в мутагенезе играет также дезаминирование 5-mCyt , особенно в клетках высших эукариот, где это модифицированное основание выполняет регуляторные функции и составляет ~3% от общего количества Cyt в ДНК [ Ванюшин ea 2005 ]. Скорость дезаминирования 5-mCyt в 3-4 раза выше, чем для Cyt [ Pfeifer, ea 2006 ]; в результате этой реакции получается Thy, каноническое основание ДНК. Таким образом, в отсутствие репарации дезаминирование 5-mCyt также мутагенно и приводит к возникновению транзиций C-T . В реакции ферментативного метилирования Cyt происходит образование ковалентного интермедиата между C6 основания Cyt и остатком Cys активного центра цитозинметилтрансферазы ; такой интермедиат также очень легко подвергается дезаминированию при сниженных концентрациях S- аденозилметионина, вызывающих замедление реакции [ Shen, ea 1992 ]. Последовательности CG , в которых в клетках эукариот обычно происходит метилирование Cyt, представляют собой горячие точки мутагенеза [ Pfeifer, ea 2006 ]; механизмы репарации гетеродуплексов T:G обсуждаются в разд. ДНК-гликозилазы
Пуриновые основания, содержащие экзоциклические аминогруппы - Ade и Gua - спонтанно дезаминируются в физиологических условиях со скоростью в ~50-100 раз меньшей, чем Cyt, с образованием гипоксантина (Hyp) и ксантина (Xan) соответственно [ Karran, ea 1980 ]. Так же, как и Cyt, эти основания дезаминируются и под действием HNO2 со скоростью, примерно равной скорости дезаминирования Cyt [ Schuster, ea 1960 ]. При биосинтезе пуриновых dNTP в клетке в норме не образуется заметного количества дезаминированных dNTP, поэтому в отличие от dUMP, включения dIMP и dXMP при репликации in vivo не происходит [ Lin, ea 2001 ]. Hyp в составе ДНК способен образовывать неканонические пары оснований с Cyt и Ade [ Ohtsuka, ea 1985 ], и его возникновение в ДНК представляет собой потенциально мутагенный процесс, в E.coli преимущественно приводящий к транзициям A-G [ Hill-Perkins, ea 1986 ]. Xan также может быть причиной мутагенеза, поскольку ДНК-полимеразы включают напротив этого основания как dCMP, так и TMP [ Wuenschell, ea 2003 ].
