AP сайты (апурин-апиримидиновые сайты)

Расщепление N-гликозидной связи дезоксинуклеотидов в составе ДНК приводит к возникновению в ней апурин-апиримидиновых сайтов (AP-сайтов). По сравнению с РНК, ДНК более подвержена гидролизу N-гликозидных связей, который в особенности проявляется в кислотных условиях, но идет с достаточной скоростью и при физиологических значениях температуры и pH [ Greer, ea 1962 , Lindahl, ea 1972 ]. Гидролиз N-гликозидной связи инициируется протонированием азотистого основания, эффективность которого в значительной степени зависит от pKa протонируемого атома (N7 в основании Gua, N1 в Ade, N3 в Cyt, O2 в Thy) [ Zoltewicz, ea 1970 , Garrett, ea 1972 , Shapiro, ea 1972 ].

Как следствие, в близких к физиологическим условиях скорость гидролиза N-гликозидной связи dGuo примерно в 1,5 раза выше, чем dAdo, в то время как в пиримидиновых дезоксинуклеотидах она ниже на 1-2 порядка, чем в пуриновых, поэтому обычно при описании процесса спонтанной потери оснований в ДНК говорят об апуринизации ДНК . При некоторых повреждениях оснований ДНК скорость апуринизации значительно повышается: так, среднее время гидролиза 3-mdAdo в двуцепочечной ДНК составляет 36ч, а 7-mdGuo - 11-72ч [ O'Brien, ea 2004 ]. AP-сайты также образуются как интермедиаты в процессе ЭРО после действия ДНК-гликозилаз (см. общий механизм ЭРО ); этот процесс вносит важный вклад в общее число AP-сайтов за счет выщепления урацил-ДНК-гликозилазой оснований Ura, включившихся в ДНК при репликации [ Guillet, ea 2003 ].

Оценки скорости спонтанной апуринизации в живых клетках при нормальных условиях варьируют от 0,05-0,15/106 оснований в час по данным экстраполяции скорости термической апуринизации к физиологическим условиям (k~3?10?11с?1 при pH7,4 и температуре 37*C) [ Lindahl, ea 1972 ] до 10-30*106 оснований в час по данным модификации AP-сайтов специфическими реагентами in situ [ Atamna, ea 2000 ]. В клетках E.coli это примерно соответствует образованию 1 AP-сайта за клеточный цикл. Число AP-сайтов, присутствующих в любой момент времени в клетках млекопитающих, составляет ~5-20*106 оснований [ Atamna, ea 2000 ]. Число AP-сайтов значительно повышается при генотоксическом стрессе (ионизирующие излучения и т.п.).

AP-сайты химически нестабильны и на их месте под действием повышенной температуры, основных и нуклеофильных реагентов и ионов Mg2+ могут возникать одноцепочечные разрывы ДНК ; в физиологических условиях время полупревращения AP-сайта составляет несколько дней [ Lindahl, ea 1972 ]. В связи с высокой лабильностью AP-сайты невозможно непосредственно вводить в ДНК синтетическим путем. Для исследования этих поврежденных дезоксинуклеотидов в настоящее время используют ДНК-субстраты, содержащие предшественники, которые могут быть превращены в AP-сайты ферментативной или химической обработкой, например, dUrd с обработкой урацил-ДНК-гликозилазой (разд. UNG ). Кроме того, большое распространение для исследования биологических свойств получили стабильные неальдегидные аналоги AP-сайтов, из которых следует особо выделить (3-гидрокситетрагидрофуран-2-ил)метилфосфат (THF) [ Takeshita, ea 1987 ]. Несмотря на некоторые отличия в путях репарации альдегидных AP-сайтов и этих аналогов, они достаточно точно отражают свойства альдегидных AP-сайтов при взаимодействии с большинством изученных белков.

Ввиду невозможности образовывать канонические пары оснований, AP- сайты эффективно блокируют действие ДНК-полимераз и высокомутагенны in vitro [ Shearman, ea 1977 ]. Многие ДНК-полимеразы при достижении AP-сайтов ДНК-матрицы останавливаются, а затем либо диссоциируют, либо катализируют включение dAMP напротив AP-сайтов ДНК-матрицы [ Goodman, ea 1994 , Taylor, ea 2002 ]. Эта закономерность включения dNMP, получившая название правило A , объясняется, по-видимому, тем, что пара AP:dAdo в ДНК отличается наибольшей термодинамической стабильностью, энергией стэкинг- взаимодействий и наименьшими отклонениями конформации ДНК от пар с участием канонических дезоксинуклеотидов [ Cuniasse, ea 1990 ], а также лучше других подходит к структуре активного центра ДНК-полимераз [ Gestl, ea 2005 ]. Блокирование ДНК-полимераз частично объясняется постоянно повторяющейся экзонуклеолитической коррекцией, которая при включении dAMP меньше, чем при включении других dNMP [ Goodman, ea 1994 , Ide, ea 1995 ]. Плохие субстратные свойства матриц с AP-сайтами объясняются также переходом ДНК-полимераз в каталитически неактивную конформацию и ингибированием транслокации после включения dNMP при наличии этого типа поврежденных звеньев в активном центре [ Hogg, ea 2004 ]. Транслезионные ДНК-полимеразы отличаются значительно большей эффективностью использования AP-сайтов по сравнению с репликативными и репаративными ДНК-полимеразами, но включение dNMP напротив AP-сайтов все равно сопровождается значительной мутагенностью [ Taylor, ea 2002 , Fleck, ea 2004 ]. Наиболее эффективный синтез ДНК наблюдается при использовании двух ДНК- полимераз, одна из которых может с достаточной эффективностью включать dNMP напротив AP-сайта, а другая - включать следующий dNMP [ Haracska, ea 2001 ]. Работа как репликативных, так и транслезионных ДНК-полимераз на AP-содержащих матрицах может до некоторой степени стимулироваться вспомогательными факторами репликации: b/g/d-комплексом и белком Ssb бактерий [ Tomer, ea 1998 ], PCNA , RFC и RPA эукариот [ Daube, ea 2000 ].

Репликативные ДНК-полимеразы, отличающиеся большой частотой ошибок (напр., обратная транскриптаза HIV- 1 или AMV), транслезионные полимеразы, а также ДНК-полимераза-b могут включать напротив AP-сайта и другие основания и с повышенной частотой приводить к делециям [ Goodman, ea 1994 , Cai, ea 1993 ]. Структурные и кинетические данные для ДНК-полимеразы Dpo4 из Sulfolobus solfataricus позволяют предположить, что основным механизмом включения dNMP при наличии AP-сайта в матрице может быть выпетливание и проскальзывание праймера [ Ling, ea 2004 ]; эта гипотеза подтверждается также кинетическими данными для ДНК-полимеразы бактериофага T7 [ McCulloch, ea 2006 ].

In vivo AP-сайты высоколетальны, но в определенных условиях могут индуцировать мутации. При анализе мутагенеза в AP-содержащей плазмидной ДНК спектр мутаций in vivo, как правило, ограничен в соответствии с правилом A заменами исходного основания на Thy [ Avkin, ea 2002 ]. Однако при анализе хромосомных мутаций большая их часть представляет собой замены, соответствующие включению dCMP напротив поврежденного звена, катализируемому транслезионной ДНК-полимеразой зета [ Auerbach, ea 2005 ]. Также AP-сайты способны индуцировать дистанционный мутагенез по тому же механизму, что и 8-oxoGua [ Miller, ea 1997 ].

Кроме этого, цитотоксическое действие AP-сайтов может быть обусловлено тем, что они частично блокируют транскрипцию РНК- полимеразами [ Chen, ea 1993 ]. Если NMP все же включается, большинство РНК-полимераз также подчиняются правилу A , включая AMP напротив AP-сайта в ДНК- матрице [ Chen, ea 1993 ]. AP-сайты ингибируют экзонуклеазную активность белка WRN [ Machwe, ea 2000 ] и при наличии в последовательности, сайта узнаваемого топоизомеразой I , образуют необратимые ковалентные комплексы с ферментом [ Pourquier, ea 1997 ].

Ссылки:

Все ссылки