ДНК-гликозилазы: общие сведения
Наиболее распространенные типы повреждения ДНК - одноцепочечные разрывы , апурин-апиримидиновые сайты и поврежденные основания - репарируются с помощью эксцизионной репарации оснований. При повреждении оснований ДНК этот процесс инициируется ферментами ДНК-гликозилазами, которые гидролизуют N-гликозидную связь между поврежденным основанием и остатком дезоксирибозы. У всех живых организмов имеется несколько ДНК- гликозилаз с разной субстратной специфичностью; так, из клеток человека и Escherichia coli на момент начала данной работы было известно по 8 ДНК-гликозилаз. Некоторые из них обладают весьма узкой субстратной специфичностью, удаляя из ДНК поврежденные основания только одного вида (например, урацил), другие же могут выщеплять разнообразные поврежденные основания, относящиеся в целом к одному классу (например, окисленные пиримидины). Исходя из последовательностей и пространственных структур, ДНК-гликозилазы можно разделить на несколько семейств, совершенно не родственных друг другу. Тем не менее, некоторые ДНК-гликозилазы, относящиеся к разным семействам, могут использовать в качестве субстрата ДНК, содержащую одно и то же поврежденное основание. Таким образом, они являют собой пример конвергентной эволюции белков, когда разные по происхождению ферменты выполняют одну и ту же функцию в клетке.
До сих пор не решен вопрос, каким образом ДНК-гликозилазы осуществляют дискриминацию субстратных и несубстратных азотистых оснований. Многие поврежденные азотистые основания отличаются от канонических оснований ДНК всего одним или несколькими атомами, поэтому фермент должен с исключительной точностью выбирать выщепляемое основание на фоне огромного избытка неповрежденных звеньев ДНК. С другой стороны, многие поврежденные азотистые основания могут быть очень похожими на основания, выщепляемые какой-либо ДНК-гликозилазой, но не использоваться ей в качестве субстрата. Ясно, что связывание субстратного основания в активном центре фермента должно предваряться его селекцией среди других оснований, которые в принципе могут, но не должны служить субстратами. Изучение механизмов такой селекции субстратов на сегодняшний день чрезвычайно актуально не только для углубления знаний собственно о репарации ДНК, но и для понимания механизма действия ферментов вообще и создания белковых катализаторов с заданными свойствами.
Для исследования ДНК-гликозилаз на сегодняшний день применяются самые передовые подходы физико-химической биологии. Строение ряда ДНК- гликозилаз установлено методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. Создан большой набор модифицированных звеньев ДНК, позволяющий анализировать закономерности узнавания поврежденных оснований. Современные молекулярно-биологические методы позволяют получать формы белков с измененной структурой и анализировать их свойства. Однако, несмотря на это, остается большой редкостью комбинированный подход к изучению ДНК-гликозилаз, который сочетал бы различные взаимодополняющие структурные и биохимические методы в систематическом исследовании механизмов узнавания этими ферментами поврежденных оснований.
Несмотря на то, что в ДНК могут возникать поврежденные основания многих разных видов, в природе встречается ограниченное количество ДНК-гликозилаз, которые при этом обладают более или менее широкой субстратной специфичностью. Из табл. 1 , в которой перечислены известные на сегодня ДНК-гликозилазы Escherichia coli и человека, видно, что некоторые ДНК-гликозилазы очень специфичны к субстрату (например, фермент MBD4 , который удаляет Ura и Thy в составе гетеродуплексов в контексте CG-островков ), в то время как другие могут выщеплять очень широкий круг поврежденных оснований (например, ферменты Nth или NTHL1 , проявляющие активность по отношению ко многим поврежденным пиримидиновым основаниям в составе ДНК).
Несмотря на большие различия в структурной организации, все ДНК- гликозилазы обладают некоторыми общими чертами [ Friedberg, ea 2006 , David, ea 1998 , Stivers, ea 2003 ]. Это мономерные белки сравнительно небольшого размера (~15-70кДа). Для проявления их ферментативной активности не требуются коферменты или ионы M2+, хотя некоторые ДНК-гликозилазы могут содержать ионы Fe2+ (в составе железно-серных кластеров ) или Zn2+ в качестве простетических групп. Подавляющее большинство ДНК-гликозилаз (за исключением Ung и SMUG1) проявляет специфичность в отношении двуцепочечной ДНК . Все механизмы выщепления поврежденного основания разными ДНК-гликозилазами представляют собой вариации механизма нуклеофильного замещения; более подробно они рассмотрены в разд. ДНК-гликозилазы: каталитический механизм
Разные ДНК-гликозилазы благодаря их различной субстратной специфичности осуществляют удаление конкретных модифицированных оснований ( табл. I.20 ).
ДНК-гликозилазы, участвующие в BER , способны переводить сайты, содержащие модифицированные основания (например, урацил), в некодирующие сегменты одной из цепей ДНК. Урацилгликозилазы, ассоциированные с белковыми комплексами репликативных вилок, эффективно действуют на одноцепочечные ДНК, и их активность регулируется во время клеточного цикла.
