ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ: КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ
ДНК-гликозилазы по механизму действия делятся на моно - и бифункциональные . Механизм действия ферментов обоих классов представляет собой нуклеофильное замещение поврежденного азотистого основания; в общих чертах он показан на рис. 4 . Монофункциональные ДНК- гликозилазы расщепляют только N-гликозидную связь по гидролитическому механизму, образуя AP-сайт в качестве продукта. AP-сайты довольно нестабильны и в щелочной среде подвергаются b-элиминации, что позволяет исследовать активность монофункциональных ДНК-гликозилаз, наблюдая за разделением в ПААГ продуктов реакции после обработки NaOH, пиперидином или полиаминами. Иногда для анализа продуктов реакции используют хроматографические методы: например, за реакцией, катализируемой Ung/UNG, можно следить по выщеплению [3H]Ura с разделением ВЭЖХ. Некоторые монофункциональные ДНК-гликозилазы ( MutY ) способны с очень малой эффективностью осуществлять разрыв цепи ДНК [ Zharkov, ea 1998 ], но эта реакция протекает на порядки медленнее гликозилазной и, по всей вероятности, обусловлена присутствующими в активном центре нуклеофильными остатками, не приспособленными специально для этой роли.
Напротив, бифункциональные ДНК-гликозилазы катализируют выщепление поврежденного основания и последующий разрыв цепи ДНК с равной или хотя бы сравнимой эффективностью. Во всех исследованных случаях разрыв цепи ДНК бифункциональными гликозилазами протекает по механизму b-элиминации, а не гидролиза [ Manoharan, ea 1988 , Bailly, ea 1989 , Bailly, ea 1989 , Bhagwat, ea 1996 , Kim, ea 1988 , Latham, ea 1995 , Mazumder, ea 1989 ]. Элиминация идет в син-положении уходящих групп, при этом отщепляется протон pro-S при атоме C2' и образуется транс-a,b-ненасыщенный альдозный остаток [ Mazumder, ea 1991 , Mazumder, ea 1989 ]. Это отличает b-элиминацию AP-сайтов, катализируемую бифункциональными ДНК-гликозилазами, от щелочной, которая протекает в анти-положении [ Mazumder, ea 1991 ]. Ряд бифункциональных ДНК-гликозилаз после стадии b-элиминации катализирует еще одну реакцию b-элиминации (обычно называемую d- элиминацией), что приводит к образованию в ДНК однонуклеозидной бреши, обрамленной фосфатными группами [ Bailly, ea 1989 , Jiang, ea 1997 ]; такой последовательный механизм был строго доказан, в частности, для фермента Fpg при мечении фосфатных групп 18^O и 31^P с последующей идентификацией продуктов методами масс-спектрометрии и 31^P-ЯМР [ Bhagwat, ea 1996 ].
Несмотря на разные продукты реакции, единственное принципиальное различие между механизмами моно- и бифункциональных ДНК-гликозилаз заключается в природе нуклеофильной группы, что позволило С.Ллойду и М. Додсону предложить единый каталитический механизм ДНК-гликозилаз [ Sun, ea 1995 , Dodson, ea 1994 ]. В случае монофункциональных гликозилаз в роли нуклеофила выступает активированная молекула воды; замещение ей азотистого основания приводит к образованию AP-сайта ( рис. 4А ). В случае бифункциональных гликозилаз нуклеофилом служит аминогруппа, принадлежащая одному из аминокислотных остатков фермента, которая замещает основание с образованием ковалентного интермедиата - протонированного основания Шиффа ( рис. 4Б ). Этот интермедиат затем претерпевает b-элиминацию с разрывом цепи (AP-лиазная активность бифункциональных ДНК-гликозилаз) и гидролизуется, восстанавливая активную форму фермента.
Для доказательства принадлежности какой-либо ДНК-гликозилазы к группе моно-или бифункциональных используется два основных подхода. Во-первых, исследуется накопление расщепленного по сахарофосфатному остову ДНК- продукта до и после щелочной обработки; лишь в случае монофункциональных гликозилаз она необходима для расщепления цепи ДНК. Эксперименты второго типа основаны на том, что основание Шиффа, образующееся в ходе катализа с участием бифункциональных ДНК-гликозилаз, можно восстановить (обычно для этих целей используют NaBH4 или NaBH3CN , рис. 4Б ) с образованием негидролизуемого ковалентного комплекса между ферментом и ДНК, который обнаруживается при разделении реакционной смеси в ПААГ как продукт с низкой электрофоретической подвижностью. Иногда для доказательства образования основания Шиффа в ходе реакции используют ингибирование AP- лиазной активности фермента цианидами, вызванное обратимым присоединением CN- по основанию Шиффа, что предотвращает b-элиминацию [ Dodson, ea 1993 ].
Для однозначного выявления аминокислотных остатков, участвующих в образовании основания Шиффа, обычно используют сшивку NaBH4 с последующим протеолизом и идентификацией остаточного пришитого к ДНК пептидного фрагмента секвенированием по Эдману или методами масс- спектрометрии [ Zharkov, ea 1998 , Zharkov, ea 1997 , Rieger, ea 2000 , Ikeda, ea 1998 ]; применяемые иногда для этой цели методы сайт-направленного мутагенеза не дают прямого ответа на вопрос, играет ли данная аминогруппа роль нуклеофила при замещении или нужна для других целей в катализе.
Как правило, бифункциональные ДНК-гликозилазы содержат в активном центре два остатка, абсолютно необходимых для проявления их ДНК- гликозилазной функции. Один из них - уже упомянутый нуклеофильный остаток, образующий основание Шиффа. В случае DenV роль каталитического нуклеофила выполняет N-концевой остаток Thr [ Schrock, ea 1991 , Schrock, ea 1993 ], а в случае Fpg и Nei - N-концевой остаток Pro [ Zharkov, ea 1997 , Rieger, ea 2000 ], образующиеся после отщепления инициирующего остатка формилметионина. У бифункциональных ДНК-гликозилаз Nth суперсемейства в этом качестве выступает остаток Lys мотива HhH (напр., Lys120 в Eco-Nth или Lys249 в hOGG1) [ Nash, ea 1997 , Ikeda, ea 1998 ].
Второй критический для катализа остаток принадлежит аминокислоте с кислой боковой группой (Asp в белках суперсемейства Nth, Glu в DenV и, возможно, Fpg/Nei). Предполагается, что эта аминокислота активирует нуклеофильный остаток, оттягивая протон с его аминогруппы, протонирует какую-либо из позиций поврежденного дезоксинуклеозида, либо электростатически стабилизирует переходное состояние (см. ниже). Квантовомеханические расчеты для DenV показывают, что pKa карбоксильной группы Glu22 повышен на 6 единиц за счет влияния других остатков активного центра, а pKa каталитического нуклеофила Pro1, напротив, снижен на 1,5 единицы; таким образом, в системе Thr1-Glu22-ДНК при физиологических значениях pH может происходить достаточно эффективный перенос протона [ Fuxreiter, ea 1999 , Osman, ea 2000 ].
Исследования неферментативной апуринизации рибо- и дезоксирибонуклеозидов показывают, что расщепление N-гликозидной связи идет с образованием оксокарбениевого переходного состояния ( рис. 4 ), в котором связь с азотистым основанием уже практически исчезает, связь с замещающей молекулой воды только начинает образовываться, а в области C1'-O4' накапливается положительный заряд [ Zoltewicz, ea 1970 , Garrett, ea 1972 ]. Такое диссоциативное переходное состояние может быть стабилизировано электростатическими взаимодействиями с положительно заряженным фуранозным остатком или протонированием уходящего основания.
В серии работ Дж.Стиверса с соавт., посвященной каталитическому механизму Ung/UNG , было показано, что по крайней мере в случае этой монофункциональной ДНК-гликозилазы реализуется именно такой механизм [ Stivers, ea 2003 , Jiang, ea 2001 , Werner, ea 2000 , Bianchet, ea 2003 , Berti, ea 2006 ]. Значения кинетического изотопного эффекта по атомам H и C в положениях 1' и 2' дезоксирибозного цикла согласуются с диссоциативным механизмом DN*AN, в котором сначала связь C'1-N1 разрывается практически полностью, а затем оксокарбениевый ион атакуется молекулой воды. Этот вывод подтверждается результатами квантовомеханического компьютерного моделирования [ Dinner, ea 2001 ] и тем фактом, что Ung/UNG лучше всего ингибируется бипартитными аналогами переходного состояния. Примечательно, что наиболее значительный вклад в электростатическую стабилизацию оксокарбениевого переходного состояния вносят не остатками активного центра фермента, а отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК [ Jiang, ea 2001 , Dinner, ea 2001 ] и урацилат-анионом.
Из остатков активного центра для стабилизации важнее всего абсолютно консервативные остатки Asp (Asp64 в Eco-UNG, Asp146 в hUNG), взаимодействующий с оксокарбениевым катионом, и His (His187 в Eco-UNG, His268 в hUNG), взаимодействующий с урацилат-анионом.
Дополнительная стабилизация оксокарбениевого иона обеспечивается за счет эффекта гиперконъюгации связей C-H при C2' с пи-орбиталями атома C1' в 3'-экзо-конформации, которую принимает дезоксирибозный цикл в переходном состоянии [ Bianchet, ea 2003 ]. Субстратная ДНК в комплексе с ферментом, напротив, дестабилизирована за счет напряженной конформации звена dUrd [ Parikh, ea 2000 ]. Остаток Asp64(Eco-UNG)/Asp146(hUNG) также координирует и активирует атакующую молекулу воды, его замена остатком Asn снижает константу скорости реакции в ~8000 раз.
Для объяснения механизма действия и субстратной специфичности ДНК-гликозилаз, специфичных к алкилированным пуриновым основаниям ( AlkA , MPG ), была предложена так называемая пороговая модель катализа [ O'Brien, ea 2004 , O'Brien, ea 2004 ]. Многие дезоксинуклеотидные звенья, расщепляемые этими ферментами, нестабильны и спонтанно гидролизуются с константой скорости псевдопервого порядка ~10-4-10-3 мин-1 [ O'Brien, ea 2004 ], что на 4-7 порядков превышает скорость спонтанного гидролиза канонических и многих поврежденных дезоксинуклеотидов, не удаляемых этими ферментами. Поэтому относительно небольшое увеличение скорости гидролиза (~2 порядка) за счет стабилизации оксокарбениевого переходного состояния без какой-либо специфичности к субстратному основанию практически не оказывает влияния на стабильность неповрежденной ДНК, но приводит к удалению алкилированных оснований за приемлемое для клетки время.
На сегодняшний момент неясно, протекает ли катализ с участием других ДНК-гликозилаз, в особенности бифункциональных, с образованием того же типа переходного состояния, что и в случае Ung/UNG. С одной стороны, многие ДНК-гликозилазы обладают повышенным сродством к ДНК, содержащей положительно заряженные аналоги AP-сайта или пирролидиновые гомодезоксинуклеозиды, которые в некоторой степени имитируют переходное состояние диссоциативной реакции нуклеофильного замещения [ Deng, ea 1997 , Scherer, ea 1998 ].
С другой стороны, высокоэффективная AP-лиазная реакция, катализируемая бифункциональными ДНК-гликозилазами, проходит по хорошо изученному механизму нуклеофильного замещения карбонильного атома кислорода аминогруппой, которое протекает с образованием тетраэдрического интермедиата [ Purmal, ea 1996 , McCullough, ea 2001 ]; трудно себе представить, что активные центры нескольких групп ферментов, имеющих разное пространственное строение, будут одновременно оптимизированы для стабилизации двух переходных состояний разной природы - диссоциативного для ДНК-гликозилазной реакции и ассоциативного для AP-лиазной.
