FPG, MutM (8-оксигуанин-ДНК-гликозилаза)
В 1979 г. в E. coli была обнаружена ДНК-гликозилаза, выщепляющая из ДНК основание N7-метилгуанина с имидазольным кольцом, раскрытым после обработки щелочью [ Chetsanga, ea 1979 ]. Поскольку такое основание представляет собой метилированный аналог Fapy-Gua (mFapy-Gua) [ Boiteux, ea 1984 ], фермент впоследствии получил название формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg). После того, как было показано, что ДНК-гликозилаза, специфичная к основаниям 8-oxoGua , идентична Fpg [ Tchou, ea 1991 ], фермент получил еще одно название - 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза.
Ген Fpg был клонирован при поиске мутаций, селективно повышающих частоту трансверсий G-T [ Cabrera, ea 1988 ], поэтому в литературе часто можно встретить его обозначение mutM и соответственно фермент иногда называется MutM. После того, как было показано, что ДНК-гликозилаза, специфичная к основаниям 8-oxoGua, идентична Fpg [ Tchou, ea 1991 ], фермент получил еще одно название - 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза. См. Fpg ген
Eco-Fpg белок Активность Fpg по отношению к 8-oxoGua -содержащим субстратам привлекает особое внимание по причине важной биологической роли этого поврежденного основания (разд. GO система ). Штаммы E.coli, дефицитные по белку Fpg, не способны удалять 8-oxoGua и mFapy-Gua из ДНК [ Boiteux, ea 1989 , Bessho, ea 1992 ]. Определение значений KM и kcat для Fpg по отношению к 8-oxoGua и ряду его аналогов [ Tchou, ea 1994 ] позволило предположить, что для узнавания поврежденного основания необходима карбонильная группа при атоме C8 или пиррольный характер атома N7, а для катализа ДНК-гликозилазной реакции - наличие карбонильной группы при атоме C6. Однако это правило плохо объясняет субстратные свойства Fapy-Ade и окисленных пиримидиновых оснований.
Субстратная специфичность Fpg очень ярко проявляется в специфичности к основанию напротив поврежденного. Наихудшим субстратом для фермента служит пара 8-oxoGua:Ade, а из пары 8-oxoGua:Cyt поврежденное основание удаляется намного лучше [ Tchou, ea 1991 , Tchou, ea 1994 ].
По поводу относительной эффективности превращения субстратов, содержащих основания Thy и Gua напротив поврежденного, в литературе нет единого мнения, но в любом случае они используются ферментом с большей эффективностью, чем 8-oxoGua:Ade [ Tchou, ea 1994 ]. Последовательность, окружающая поврежденное основание, также может влиять на эффективность его выщепления: сообщалось, что значение константы специфичности для последовательности 5'-...CCXCC...-3' в 33 раза больше, чем для 5'-...TGXAT...-3' (X=8-oxoGua) [ Hatahet, ea 1998 ].
Для исследования субстратной специфичности ДНК-гликозилаз, принимающих участие в репарации продуктов окислительного повреждения (Fpg, OGG1, Nei, Nth и др.) применяется два основных типа экспериментов: во-первых, измерение расщепления ферментами двуцепочечных ОДН- субстратов, содержащих поврежденные звенья, введенные при синтезе, и во- вторых, измерение выщепления поврежденных оснований из высокомолекулярной ДНК, поврежденной ионизирующим излучением или химическим окислением. В последнем случае для количественного определения выщепленных оснований обычно используют ГХМС. Несмотря на высокую воспроизводимость обоих методов, существуют значительные различия в определяемом ими спектре субстратов ДНК-гликозилаз. Например, при анализе субстратной специфичности Fpg методом ГХМС фермент выщепляет из ДНК основания 8-oxoGua, Fapy-Gua и Fapy-Ade и не выщепляет 5- гидрокси-5-метилгидантоин, 5-OH-Ura, 5-OH-Cyt, Thy(OH)2 и H2Thy, которые эффективно удаляются из ОДН-субстратов [ Karakaya, ea 1997 , Boiteux, ea 1992 ]. Сходная ситуация наблюдается при сравнении определенной этими методами субстратной специфичности фермента Nei [ Dizdaroglu, ea 2001 ]. Причины такого расхождения между методами на сегодняшний день неизвестны.
Помимо ДНК-гликозилазной активности, фермент Fpg обладает ассоциированной AP-лиазной активностью [ Boiteux, ea 1990 , O'Connor, ea 1989 ], а также способен выступать в роли dRP-лиазы , отщепляя 5'-концевой остаток 2'-дезоксирибо-5'-фосфата, образующийся в ДНК под действием AP- эндонуклеаз [ Graves, ea 1992 ]. В отличие от бифункциональных ДНК-гликозилаз, принадлежащих к суперсемейству Nth, Fpg эффективно катализирует как b-, так и d-элиминацию, оставляя на месте поврежденного звена однонуклеозидную брешь, обрамленную фосфатными группами [ Bailly, ea 1989 ]. По всей вероятности, эти реакции протекают без распада фермент-субстратного комплекса, поскольку Fpg не проявляет активности по отношению к субстратам, представляющим собой продукты b-элиминации [ Bailly, ea 1989 ]. Методами ЯМР и масс-спектрометрии было показано, что в ходе реакции углеводный фрагмент поврежденного дезоксинуклеотида высвобождается в виде транс-4-оксопент-2-еналя [ Bhagwat, ea 1996 ].
При обработке NaBH4 или NaBH3CN комплекса Fpg с субстратом происходит образование стабильного ковалентного комплекса [ Sun, ea 1995 , Tchou, ea 1995 ]. Масс-спектрометрический анализ продуктов трипсинолиза этого комплекса позволил установить, что катализ выщепления основания ферментом Fpg проходит с образованием основания Шиффа между остатком Pro1 и атомом C1'поврежденного дезоксинуклеотида [ Zharkov, ea 1997 ]. Замена остатка Pro1 на другие аминокислотные остатки приводит к значительной или полной инактивации Fpg в зависимости от субстрата и типа введенного аминокислотного остатка [ Tchou, ea 1995 , Sidorkina, ea 2001 ]. Таким образом, члены семейства Fpg образуют в качестве интермедиата основание Шиффа пирролидиновой природы, несущее постоянный положительный заряд на атоме азота; возможно, именно эта особенность фермента Fpg стимулирует его гораздо более высокую активность в реакции d-элиминации по сравнению с другими AP-лиазами.
Помимо Pro1, методами сайт-направленного мутагенеза в Fpg были выявлены несколько позиций, важных для активности или субстратной специфичности фермента. Замена или химическая модификация остатков Cys в мотиве цинкового пальца приводит к потере ферментом способности связывать ДНК и соответственно к потере активности [ O'Connor, ea 1993 , Tchou, ea 1993 ]. При систематическом исследовании роли консервативных кислотных остатков в Fpg выяснилось, что замена остатков Glu2 и Glu173 остатками Gln инактивирует фермент, а остатков Glu5 и Glu131 - значительно снижает его ДНК-гликозилазную активность [ Lavrukhin, ea 2000 ]. Интересно, что влияние этих замен на AP-лиазную активность фермента оказалась гораздо меньше [ Lavrukhin, ea 2000 ]. Также разное влияние на активность фермента по отношению к различным поврежденным основаниям и к AP-сайтам оказывают замены остатков Lys56 [ Sidorkina, ea 2001 ] и Lys155 [ Rabow, ea 1997 ]: как правило, активность разных мутантных форм фермента по отношению к 8- oxoGua снижается довольно значительно, а к другим субстратам - гораздо меньше.
Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
(mismatch repair)
