Nei (Эндонуклеаза VIII)
Эндонуклеаза VIII (endonuclease eight, Nei) была впервые выделена в 1994 г. С. Уоллес и сотр. [ Melamede, ea 1994 ] из экстрактов штамма E. coli, дефицитного по гену nth, как второй фермент, способный расщеплять плазмидную ДНК, поврежденную OsO4. Общая активность Nei в клетках E. coli, измеренная в этой реакции, составляет ~10% от активности Nth [ Melamede, ea 1994 ].
Получение гомогенного белка позволило клонировать nei ген по последовательности пептидных фрагментов [ Jiang, ea 1997 ].
Nei представляет собой ДНК-гликозилазу с ассоциированной AP- лиазной активностью [ Melamede, ea 1994 ]. Как и Fpg , фермент катализирует последовательные реакции b,d-элиминации [ Jiang, ea 1997 ] с образованием на месте поврежденого звена ДНК однонуклеозидной бреши, обрамленной фосфатными группами, и высвобождением поврежденного основания и углеводного фрагмента в виде 4-оксопент-2-еналя. В процессе катализа Nei образует с поврежденной ДНК ковалентную связь, восстанавливаемую NaBH4 ; методом пептидного картирования показано, что каталитическим нуклеофилом фермента Nei, как и в случае Fpg, служит N-концевой остаток Pro [ Rieger, ea 2000 ]. Активность фермента не зависит от ионов M2+, за исключением, возможно, иона Zn2+, входящего в состав цинкового пальца [ Melamede, ea 1994 , Jiang, ea 1997 ].
Субстратная специфичность Nei во многом перекрывается со специфичностью фермента Nth. В литературе сообщалось о расщеплении ферментом Nei ДНК-субстратов, содержащих остатки окисленных пиримидинов Thy(OH)2 [ Dizdaroglu, ea 2001 , Melamede, ea 1994 , Jiang, ea 1997 ], H2Thy [ Melamede, ea 1994 ], Ug [ Dizdaroglu, ea 2001 ], 5-OH-Ura [ Jiang, ea 1997 ], 5-OH-Cyt [ Jiang, ea 1997 ], 5-гидрокси-5-метилгидантоина [ Dizdaroglu, ea 2001 ], 5,6-дигидроксицитозина [ Dizdaroglu, ea 2001 ], 5-гидрокси-6-гидротимина [ Dizdaroglu, ea 2001 ], 5-гидрокси-6-гидроурацила [ Dizdaroglu, ea 2001 ], мочевины [ Melamede, ea 1994 ], b-уреидоизомасляной кислоты [ Melamede, ea 1994 ], а также остатки окисленных пуринов 8-oxoGua [ Blaisdell, ea 1999 , Hazra, ea 2000 ], mFapy-Gua [ Asagoshi, ea 2000 ], Fapy-Ade [ Dizdaroglu, ea 2001 ], ксантина [ Terato, ea 2002 ] и оксанина [ Terato,ea 2002 ]. Из этого множества субстратов выщепление из высокомолекулярной ДНК было показано только для некоторых окисленных пиримидинов и Fapy-Ade; в то же время масс-спектрометрическими методами не удалось обнаружить выщепления 8-oxoGua, 5-OH-Cyt, аллоксана, 8-oxoAde, 2-OH-Ade, Fapy-Gua и hmUra [ Dizdaroglu, ea 2001 ]. Кинетические данные для большинства этих субстратов не получены или получены в достаточно сильно отличающихся друг от друга условиях. В то же время при непосредственном сравнении кинетических параметров расщепления одних и тех же субстратов ферментами Nei и Nth видно, что они могут значительно отличаться [ Dizdaroglu, ea 2001 , Miller, ea 2004 ]. Например, Nth выщепляет (5S,6R)-Thy(OH)2 из ОДН-субстратов примерно на порядок эффективнее, чем (5R,6S)-энантиомер, в то время как для Nei наблюдается прямо противоположная картина [ Miller, ea 2004 ]. Это позволило предположить, что Nei и Nth могут играть в клетке взаимодополняющие роли.
Фермент Nei тесно связывается с двуцепочечными ОДН, содержащими устойчивые к b-элиминации аналоги AP-сайта [ Jiang, ea 1997 ]. Результаты ДНКазного футпринтинга в таких комплексах указывают на то, что взаимодействие Nei с ДНК затрагивает до 4п.н. с 5'-стороны от поврежденного звена и до 9 п.н. с 3'-стороны от него [ Jiang, ea 1997 ], в отличие от белка Fpg, дающего симметричный футпринт [ Tchou, ea 1993 ].
В дополнение к ДНК-гликозилазной и AP-лиазной активности фермент Nei обладает активностью dRP-лиазы [ Jiang, ea 1997 ], в чем тоже похож на фермент Fpg. Вероятно, именно Nei отвечает за сохранение этой активности в штаммах E.coli fpg recJ, дефицитных по обоим главным ферментам, выщепляющим из ДНК интермедиаты ЭРО - 5'- концевые dRP-фрагменты.
Методом сайт-направленного мутагенеза исследованы мутантные формы Nei, в которых заменены высококонсервативные остатки Pro1, Glu2, Glu5, Asp128, Asp159 и Glu173 [ Burgess, ea 2002 ], а также встречающаяся в природе полиморфная форма Nei-L90S [ Dizdaroglu, ea 2001 ]. Замена P1T полностью инактивирует фермент, оставляя, однако, способность образовывать основание Шиффа с AP-субстратами. Замены E2Q, E2D и E173Q ведут к потере ДНК-гликозилазной активности, но способность катализировать элиминацию AP-субстратов не затрагивается [ Burgess, ea 2002 ]. Замены E5Q, D128N и D159N практически не влияют на активность фермента, а замена L90S незначительно усиливает способность Nei выщеплять некоторые поврежденные основания.
В литературе высказывалось предположение, что Nei может служить вспомогательным ферментом для репарации 8-oxoGua [ Blaisdell, ea 1999 , Hazra, ea 2000 ]. Это мнение большей частью основано на способности высокоочищенных препаратов Nei (в том числе выделенных из штаммов fpg) расщеплять двуцепочечные ОДН, содержащие это поврежденное основание. При этом, в отличие от фермента Fpg, Nei удаляет 8-oxoGua из пары 8-oxoGua:Ade с эффективностью, превышающей эффективность выщепления 8-oxoGua этим ферментом из пары 8-oxoGua:Cyt [ Hazra, ea 2000 ]. На этом основании проводилась параллель действия Nei с активностью эукариотических ферментов OGG2 и предполагалось его промутагенное действие [ Hazra, ea 2000 ]. Следует, однако, учитывать, что Nei не способен выщеплять 8-oxoGua из высокомолекулярной ДНК [ Dizdaroglu, ea 2001 ], и что данные in vivo не согласуются с промутагенной ролью этого фермента (см. ниже). Также сообщалось о том, что Nei может взаимодействовать с C-концевым доменом MutY и вытеснять MutY из комплекса с продуктом AP:dGuo (но не AP:8-oxodGuo), катализируя после этого b,d-элиминацию AP-сайта [ Lu, ea 2006 ], и что MutY, в свою очередь, может конкурировать с Nei за связывание с субстратами 5-OH-Ura:Ade [ Lu, ea 2006 ]. Биологическое значение этих наблюдений остается неясным.
Чувствительность штаммов E.coli nei к рентгеновскому излучению слегка повышена, но в остальном их выживаемость и мутагенез в них находятся на нормальном уровне [ Jiang, ea 1997 ]. Однако двойные мутанты nth nei гораздо чувствительнее к ионизирующим излучениям и к H2O2, чем штаммы дикого типа; их выживаемость в этих условиях сравнима с выживаемостью мутантов xth nfo, у которых полностью инактивирована система ЭРО [ Jiang, ea 1997 ]. Штаммы nth nei также обладают сниженной способностью к реактивации плазмид, поврежденных OsO4 [ Najrana, ea 2000 ]. Частота возникновения мутаций, придающих устойчивость к рифампицину, и реверсий в гене lac у штаммов nth nei повышена более чем на порядок [ Jiang, ea 1997 , Blaisdell, ea 1999 , Najrana, ea 2000 ], что также свидетельствует о взаимозаменяемости активностей ферментов Nth и Nei. Подавляющее большинство возникающих в этих штаммах мутаций представляют собой транзиции G-A [ Blaisdell, ea 1999 ]. С другой стороны, не было обнаружено повышения частоты мутаций в гене supF плазмид, поврежденных OsO4 [ Najrana, ea 2000 ]. Последнее наблюдение может объясняться тем, что остатки Thy(OH)2, возникающие в ДНК при обработке OsO4, преимущественно блокируют ДНК-полимеразы, а не способствуют включению неправильного dNMP. При введении мутации nei в штаммы fpg mutY примерно вдвое увеличивается частота трансверсий G-T, характерных для 8- oxoGua (см. 8-окигуанин ), но такой же спектр мутаций характерен и для тройных мутантов fpg mutY nth [ Blaisdell, ea 1999 ].
В целом данные in vivo свидетельствуют о том, что в E.coli фермент Nei играет вторичную роль по отношению к nth. Возможно, это связано с тем, что, судя по распространенности последовательностей семейства Fpg/Nei в разных группах прокариот, ген nei возник в результате дупликации и функциональной дивергенции гена fpg в актинобактериях, а g-протеобактерии, к числу которых относится и E.coli, по-видимому, приобрели его сравнительно недавно путем горизонтального переноса [ Wallace, ea 2003 ].
