ДНК-гликозилазы в эксцизионной репарации оснований
ДНК-гликозилазы делятся на несколько типов. В результате действия монофункциональных ДНК-гликозилаз в ДНК образуется первый промежуточный продукт ЭРО - AP-сайт . AP-сайты также могут возникать за счет спонтанной апуринизации дезоксинуклеотидов в составе ДНК. Другие ДНК-гликозилазы, бифункциональные ДНК-гликозилазы , могут после удаления поврежденного основания вносить разрыв с 3'-стороны от образовавшегося AP-сайта ( рис. 3 ). Из-за этого ряд ДНК-гликозилаз при открытии получил название эндонуклеаз (например, эндонуклеаза III E.coli и эндонуклеаза VIII E.coli или эндонуклеаза V бактериофага T4 ), которое используется до сих пор, несмотря на то, что они катализируют не реакцию гидролиза фосфодиэфирной связи, а элиминацию межнуклеозидной фосфатной группы ( b-элиминации ) и таким образом не являются эндонуклеазами с точки зрения механизма реакции [ Bailly, ea 1987 , Manoharan, ea 1988 , Bailly, ea 1989 ]. Расщепляющая ДНК активность, присущая ДНК-гликозилазам, называется AP-лиазной . Продукты b-элиминации не могут служить субстратами для последующих шагов ЭРО и должны удаляться из ДНК ( рис. 2 ). Некоторые бифункциональные ДНК-гликозилазы способны катализировать две последовательных реакции элиминации межнуклеозидных фосфатов ( b,d-элиминация ), в результате чего на месте поврежденного звена образуется однонуклеозидная брешь, обрамленная фосфатными группами ( рис. 2 ), которая тоже должна подвергаться процессингу перед продолжением ЭРО. Эти различия в механизме реакции приводят к разделению ЭРО на несколько путей на самом первом этапе ( рис. 2 ). AP-сайты, образовавшиеся при действии монофункциональных ДНК-гликозилаз, служат субстратами для ферментов AP-эндонуклеаз, которые гидролизуют фосфодиэфирную связь непосредственно с 5'-стороны от AP-сайта и вносят таким образом одноцепочечный разрыв в ДНК ( рис. 3 ) [ Demple, ea 1994 ]. Ненасыщенные альдозные фрагменты - продукты b-элиминации удаляются из ДНК фосфодиэстеразной активностью, обычно также ассоциированной с AP- эндонуклеазами [ Demple, ea 1994 ].
Возникающие при b,d-элиминации 3'-фосфатные группы выщепляются из ДНК фосфатазной активностью, которая у E.coli принадлежит опять же AP-эндонуклеазам, а в клетках человека - полинуклеотидкиназе [ Demple, ea 1994 , Wiederhold, ea 2004 ]. Наконец, в недавно открытом пути инцизионной репарации AP- эндонуклеазы расщепляют ДНК с 5'-стороны от некоторых дезоксинуклеотидов с поврежденным основанием без его предварительного удаления ДНК- гликозилазой [ Ischenko, ea 2002 ] ( рис. 2 ).
Гидролиз ДНК по AP-сайту AP-эндонуклеазами приводит к появлению еще одного промежуточного продукта ЭРО - одноцепочечного разрыва с 3'- концевой OH-группой, служащей субстратом для ДНК-полимераз , и 5'- концевым остатком 2'-дезоксирибозо-5'-фосфата ( dRP ). Для завершения репарации необходим репаративный синтез ДНК (заполнение бреши) и последующее лигирование разрыва ( рис. 2 ). На этой стадии происходит еще одно разделение процесса ЭРО на пути с участием разных ферментов, называемые " короткозаплаточной ЭРО " и " длиннозаплаточной" ЭРО . В первом из этих случаев ДНК-полимераза ( ДНК-полимераза-b в клетках высших эукариот) включает один dNMP на место поврежденного звена. Остаток dRP удаляется из ДНК с участием 5'-3'-экзонуклеаз или 2'-дезоксирибозо-5'-фосфатлиаз (dRP-лиаз) , которые выщепляют dRP по гидролитическому или лиазному механизму соответственно ( рис. 2 ); в клетках высших эукариот функцию удаления dRP выполняет в основном dRP-лиазная активность ДНК-полимеразы-b . Затем осуществляется лигирование, которое в клетках высших эукариот катализирует ДНК-лигаза III в комплексе с вспомогательным белком XRCC1 .
При длиннозаплаточной ЭРО после включения первого dNMP репаративный синтез продолжается с заменой 2-20нт и вытеснением или деградацией впереди лежащей цепи ДНК; в клетках высших эукариот этот синтез ведется ДНК-полимеразой-d или ДНК-полимеразой-b с привлечением вспомогательных факторов ( PCNA , RFC , RPA ). Вытесненный участок ДНК удаляется флэп-эндонуклеазой FEN1 (в случае высших эукариот), и одноцепочечный разрыв лигируется (у высших эукариот - ДНК-лигазой I ; рис. 2 ) [ Fortini, ea 2007 ].
Недавно открыты ветви ЭРО, независимые от ДНК-гликозилаз ( инцизионная репарация ) или AP-эндонуклеаз ( рис. 2 ), однако непонятно, насколько важны эти процессы для репарации in vivo.
В данном общем изложении процесса ЭРО отсутствует большое число деталей, которые обеспечивают исключительную надежность и гибкую регуляцию этого процесса. Тем не менее, даже из этого схематического описания понятно, что центральное место в ЭРО в большинстве случаев занимают ДНК-гликозилазы, которые находят в ДНК поврежденное звено и инициируют весь процесс репарации. Таким образом, эти ферменты имеют исключительное значение для поддержания целостности геномной ДНК ; важность этой роли подчеркивается тем, что ДНК-гликозилазы встречаются во всех царствах живой природы, а также в некоторых вирусах [ Eisen, ea 1999 ].
