TDG (тимин-ДНК-гликозилаза)
(Thymine-DNA glycosylase, TDG) был выделен в чистом виде из клеток HeLa аффинной хроматографией на сорбенте, содержащем ДНК с парами Ura:Gua, и клонирован [ Neddermann, ea 1996 ]. Последовательность TDG не гомологична белкам Ung/UNG или другим известным ДНК-гликозилазам, однако TDG и Ung/UNG обнаруживают сходство пространственной укладки (разд. MUG ). См. Tdg ген человека , Mug ген E.coli
Ферменты TDG распространены среди многих эукариот, в то время как гомологи Mug обнаружены только у некоторых видов бактерий.
Подобно гликозилазам Ung/UNG, фермент TDG проявляет активность по отношению к очень ограниченному ряду субстратов, и к тому же строго специфичен к неканоническим парам, не выщепляя Thy или Ura из одноцепочечной ДНК. На активность фермента до некоторой степени влияет контекст [ Sibghat-Ullah ea 1995 , Sibghat-Ullah, ea 1996 ]. В частности, оказалось, что значение имеет природа основания с 5'- стороны от звена G в комплементарной цепи: Thy выщепляется из пар Thy:Gua почти на порядок быстрее, если в комплементарной цепи присутствует последовательность CG по сравнению с TG, GG и AG, чего и следовало ожидать для специфической репарации продуктов дезаминирования в CG-островках . Однако полный анализ контекстной специфичности TDG в настоящее время не проведен.
Еще эффективнее, чем основания Thy, фермент TDG выщепляет основания Ura из пар Ura:Gua [ Neddermann, ea 1994 ]. Основания Thy также выщепляются из пар Thy:Thy и Thy:Cyt, но с гораздо меньшей эффективностью. TDG проявляет активность по отношению к парам BrUra:Gua, что не удивительно ввиду близких стерических характеристик оснований BrUra и Thy [ Neddermann, ea 1994 ]. Фермент достаточно толерантен к модификациям основания Gua [ Sibghat-Ullah ea 1995 , Sibghat-Ullah, ea 1996 ]. Выдвигалось предположение, что эффективные субстраты TDG способны образовывать пары оснований типа "качания", которые вносят общие конформационные изменения в ДНК, узнающиеся ферментом. TDG не выщепляет из ДНК 4-метилтимин, что может свидетельствовать о стерических ограничениях в активном центре фермента [ Sibghat-Ullah, ea 1996 ] и напоминает неспособность ферментов Ung/UNG выщеплять основания, содержащие заместители в некоторых позициях (BrUra, Thy). Помимо Thy и Ura, ферменты Mug/TDG эффективно выщепляют из ДНК основания - Cyt из пар с Gua [ Saparbaev, ea 1998 ]. Такая широкая субстратная специфичность фермента, по всей вероятности, обусловлена особенностями строения его активного центра (см. разд. MUG ).
TDG и Mug очень сильно ингибируются AP-продуктом реакции и стимулируются AP-эндонуклеазами [ Waters, ea 1999 , Sung, ea 2000 , Hardeland, ea 2002 ]. Активность TDG может регулироваться ковалентной модификацией с присоединением убиквитинподобных белков SUMO , что отличает его от всех других ДНК-гликозилаз [ Hardeland, ea 2002 ]. Конъюгация с SUMO белка, тесно связанного с AP-продуктом ДНК- гликозилазной реакции, приводит к быстрой диссоциации этого комплекса и таким образом стимулирует активность фермента, после чего фрагмент SUMO может отщепляться. Помимо этого, конъюгация с SUMO влияет на внутриклеточную локализацию TDG [ Takahashi, ea 2005 ].
Достаточно неожиданно для фермента ЭРО, белок TDG был идентифицирован при поиске полипептидов, взаимодействующих с рецептором ретиноевой кислоты RAR и его гомологом RXR - факторами транскрипции, которые связывают различные изомеры ретиноевой кислоты и активируют транскрипцию ряда генов [ Um, ea 1998 ]. Дальнейшие исследования показали, что TDG действительно связывается с этими рецепторами, а также с эстрогеновым рецептором ERa , и действует при этом как коактиватор транскрипции [ Um, ea 1998 , Chen, ea 2003 ]. Возможное участие TDG в регуляции транскрипции также можно предположить из его ассоциации с гистонацетилазой CBP/p300 [ Tini, ea 2002 ]. TDG ацетилируется CBP/p300, что приводит к потере способности гликозилазы стимулироваться APEX1 .
Еще один пример нетипичных для ДНК-гликозилаз в целом белок- белковые взаимодействия с участием TDG - образование этим белком комплексов с фактором эксцизионной репарации нуклеотидов XPC-RAD23B [ Shimizu, ea 2003 ]. XPC-RAD23B оказывает аддитивный эффект на скорость реакции, катализируемой TDG , увеличивая число оборотов фермента после выщепления Thy из пары с Gua. Механизм такой стимуляции на данный момент неизвестен, но может заключаться в непосредственном вытеснении ДНК- гликозилазы из комплекса с AP-продуктом или в связывании AP-продукта гетеродимером XPC-RAD23B, узнавающим разные типы поврежденных звеньев ДНК [ Friedberg, ea 2006 ].
В отличие от ярко выраженного мутагенного фенотипа штаммов E.coli ung с преимущественным образованием транзиций C-T , инактивация гена mug в E.coli не приводит к заметному увеличению частоты транзиций C-T [ Lutsenko, ea 1999 ], что может свидетельствовать о том, что способность Mug выщеплять основания Ura не имеет биологического значения. Экстракты клеток E.coli ung mug+ практически не выщепляют Ura из пар с Gua, но, в отличие от экстрактов E.coli mug, способны эффективно выщеплять eCyt. Возможно, eCyt служит основным субстратом для ферментов Mug/TDG in vivo.
