Мутационный анализ: общие сведения
Поиск неизвестных мутаций и выявление известных мутаций - это разные диагностические задачи. Крупные мутации легче обнаружить. Блоттинг по Саузерну и ПЦР позволяют выявить увеличение числа тринуклеотидных повторов, делеции, вставки и другие перестройки ДНК. Если предполагается, что транскрипция мутантного аллеля может быть резко снижена, то сначала подтверждают гетерозиготность по исследуемому экзону с помощью обычных методов анализа полиморфизма, а затем методом ПЦР с обратной транскрипцией анализируют соотношение между мРНК двух аллелей. Такой подход позволяет выявить любую мутацию, существенно снижающую уровень мРНК.
Для выявления точечных мутаций нужны методы с более высоким разрешением.
Для выявления неизвестных мутаций лучше всего подходят следующие методы: электрофорез в денатурирующем градиентном геле, модификация карбодиимидом, химическое или ферментативное расщепление некомплементарных сайтов, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК, гетеродуплексный анализ и определение нуклеотидной последовательности ДНК ( рис. 65.9 ).
Для определения нуклеотидной последовательности используют непосредственно продукт ПЦР , отдельные клоны или объединенные клоны. Чувствительность методов выявления мутаций - от 80 до почти 100%, причем в качестве исходного материала используют либо ДНК, либо мРНК ( кДНК ).
Наличие укороченных белков свидетельствует в основном о нонсенс-мутации или о мутации со сдвигом рамки считывания .
Для выявления широко распространенных мутаций разработаны методы, основанные на гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами, аллель-специфической амплификации, лигазной цепной реакции, лигировании олигонуклеотидных зондов, определении последовательности нуклеотидов достроенного праймера и рестрикционном анализе (включая внесение новых рестрикционных сайтов; рис. 65.9 ). Высокая чувствительность всех этих методов, способных выявлять замену единственного нуклеотида, определяется специфичностью гибридизации и ферментативной реакции.
