Саузерн-блот гибридизация (Southern blot hybridization)

Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану. В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране (Саузерн-блот гибридизация, Southern blot hybridization). Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами ( рис. 65.6 ). Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть генома.

Значимость метода для медицины обусловлена возможностью исследовать определенный фрагмент геномной ДНК у любого человека.

Метод используют для выявления крупных перестроек в ДНК и некоторых точечных мутаций (большинство точечных мутаций этим методом выявить нельзя).

Денатурация ДНК осуществляется с щелочью. После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухчепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.

Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. После переноса одночепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле. 3. Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радионуклидам или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16-30 пар осваний), или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.

При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифические связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры.

Радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДНК.

Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител.

Итак: Саузерн-блот гибридизация - метод анализа структуры заданной области генома, основанный на:

- 1) расщеплении геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ;

- 2) разделении множества полученных фрагментов с помощью электрофореза в плоской пластине агарозного или другого геля;

- 3) перенесении продуктов разделения на лист пористого материала, например, на нитроцеллюлозный фильтр таким образом, что все фрагменты ДНК переносятся на фильтр и закрепляются на нем, создавая отпечаток, идентичный распределению фрагментов в геле после разделения;

- 4) гибридизации фильтра с меченым радиоактивно или с помощью красителя фрагментом ДНК или РНК (пробой), который по последовательности соответствует анализируемому участку генома. В результате, проба за счет комплементарных взаимодействий связывается с теми участками фильтра, где находятся исследуемые фрагменты генома, и положение этих фрагментов идентифицируется по положению метки из пробы на фильтре.

И как было сказано выше, с помощью Саузерн-блот гибридизации удается определять идентичность или различие длин фрагментов ( полиморфизм длин рестриктных фрагментов, ПДРФ ), получаемых при рестриктном расщеплении одного и того же локуса в разных сравниваемых геномах.

.

Ссылки:

Все ссылки