Диагностика опухолевых проб из крови и костного мозга
Кровь часто используется как источник биологического материала для диагностических целей. Составные части порфирина , получаемые из гема , являются ингибиторами ПЦР , и пробы ПЦР, содержащие достаточное количество гемоглобина , чтобы вызвать слабое красноватое обесцвечивание, доказывают наличие ингибирования. Известно, что гепарин также подавляет увеличение ПЦР Эти проблемы можно преодолеть, если перед ПЦР произвести очистку ДНК от лейкоцитов.
Кровь для анализов ДНК надо собирать в пробирку (для EDTA ) с фиолетовой крышкой или (для ACD ) с желтой крышкой. Затем необходимо растворить эритроциты каким-либо детергентом (например, хлоридом аммония) или отделить клетки с ядрами по светлому слою кровяных сгустков. 10 в 6-ой степени клеток ДНК дадут 5-10 мг ДНК, достаточно для одного ряда Саузерн-блота и для многократного увеличения ПЦР (на 100 нг за одно увеличение). Необходимо хорошо промыть ядерный осадок в пробирке, прежде чем приступать к обработке ПЦР. При экстракции ДНК из ядерных клеток крови у пациента с нормальной численностью лейкоцитов получится хороший выход ДНК, в диапазоне 10-40 мг/мл от всей крови. ДНК также можно получить из сгустков крови (пробирка с красным наконечником), но для раздробления сгустка нужно провести гомогенизацию пробы. Аналогичным образом высококачественную ДНК можно получить из пунктата костного мозга; для этого лучше всего заморозить пробы до начала экстракции ДНК и с помощью гомогенизации произвести раздробление частиц и фрагментов.
Особый интерес в гематологии представляет экстракция ДНК из мазков крови. Сохранить пробы крови и пунктат костного мозга для ретроспективного анализа ДНК можно, высушив на воздухе мазки, нанесенные на предметное стекло, и сохранив их при обычной температуре. Мазки можно зафиксировать на предметных стеклах этанолом или метанолом. При использовании мазков крови для экстракции ДНК необходимо принять во внимание число ядерных клеток в мазке; нужно сделать несколько мазков, потому что в цельной крови содержится меньше ядерных клеток, чем в пунктатах костного мозга. Было показано, что при общей численности лейкоцитов, равной 5000/мл в мазке крови, в 100 мл крови содержалось около 500 тыс. клеток или около 3 мг ядерной ДНК.
