Генодиагностика: примеры выявления мутаций
Как показано на рис. 65.24 , для выявления мутации используют разные молекулярно-генетические методы, в зависимости от характера мутации. Учитывают, каков самый распространенный тип мутации при данной болезни, размер измененной последовательности (большие перестройки или точечные мутации), относятся ли они к распространенным стабильным мутациям, или они более гетерогенны и возникли относительно недавно ( табл. 65.8 ).
Крупные молекулярные дефекты, выявляемые с помощью блоттинга по Саузерну , вызывают такие болезни, как альфа-талассемия , некоторые формы бета-талассемии , наследственная персистенция гемоглобина F ( рис. 65.25 ). Миодистрофия Дюшенна/Беккера в 60-70% вызваны крупными делециями, легко выявляемыми с помощью блоттинга по Саузерну ( рис. 65.26 ). Для выявления гетерозигот особенно удобен вариант, показанный на 1-й дорожке ( рис. 65.26 ), с новым фрагментом ДНК, который будет абсолютным диагностическим признаком наличия мутантного гена у женщин в этой семье. В случае других делеций (как на 3-й дорожке геля) выявление гетерозигот основано на количественном анализе, поскольку гетерозиготные женщины будут отличаться лишь снижением интенсивности некоторых полос в геле. Этот анализ более сложен, требует тщательного измерения и хорошего внутреннего контроля. При точечных мутациях блоттинг по Саузерну может не выявить нарушений (2-я дорожка).
Делеции, характерные для миодистрофии Дюшенна/Беккера, выявляют также с помощью ПЦР ( рис. 65.27 ). Делеции распознают по отсутствию определенных полос после электрофоретического разделения продуктов мультиплексной ПЦР (одновременной амплификации нескольких участков гена).
Мутации в виде увеличения числа тринуклеотидных повторов вызывают атрофическую миотонию , умственную отсталость при синдроме ломкой Х-хромосомы , болезнь Гентингтона , Х-сцепленную бульбоспинальную амиотрофию ( синдром Кеннеди ) и другие дегенеративные заболевания ЦНС . Для умственной отсталости при синдроме ломкой Х-хромосомы и атрофической миотонии характерно явление антиципации : в каждом следующем поколении с увеличением числа тринуклеотидных повторов болезнь протекает все тяжелее ( рис. 65.28 ). Несмотря на эту зависимость, предсказание характера заболевания требует опыта и осторожности. В зависимости от длины участка, содержащего тринуклеотидные повторы, эти мутации выявляют с помощью блоттинга по Саузерну или ПЦР.
Многие аутосомно-рецессивные , аутосомно-доминантные и Х-сцепленные болезни , незначительно влияющие на биологическую приспособленность, обычно вызваны распространенными мутациями, но даже такие мутации весьма гетерогенны, как, например, при бета-талассемии ( рис. 65.4 ).
Мутация дельтаF508 составляет в большинстве популяций 70% всех мутаций, вызывающих муковисцидоз , а остальные 30% приходятся на сотни других мутаций.
Известные мутации лучше всего исследовать с помощью гибридизации с аллель-специфическим олигонуклеотидным зондом. Обычно для постановки диагноза нужно выявить один из нескольких аллелей при недостаточности альфа1-антитрипсина и из 10-30 при бета-талассемии или муковисцидозе ( рис. 65.29 и рис. 65.30 ).
Иногда выявление конкретной мутации затруднено из-за гетерогенности точечных мутаций, в том числе тех, которые вызывают аутосомно-доминантные и Х-сцепленные болезни , снижающие биологическую приспособленность.
При гетерогенных мутациях необходимо исследовать весь ген. Определение нуклеотидной последовательности всех экзонов в гене осуществимо только при короткой кодирующей области, и поэтому его используют только для некоторых генов. Чаще всего полное определение нуклеотидной последовательности генов дорого и нецелесообразно.
Анализ на укороченные белки полезен для выявления некоторых классов мутаций, особенно при аденоматозном полипозе толстой кишки ( рис. 65.31 ) и семейном раке молочной железы типа 1. Часто поиск мутаций - это задача для научно-исследовательских лабораторий, выходящая за рамки возможностей медицинских учреждений.
