Специфические методы исследований в молекулярной биологии
I. Анализ ДНК методом Саузерна . Один из способов проанализировать ДНК микроорганизма носит имя его изобретателя - Е.М. Саузерна. Выделенную ДНК разделяют на небольшие фрагменты с помощью бактериальных ферментов, называемых рестрикционными эндонуклеазами . Образовавшиеся фрагменты ДНК затем сортируют по фракциям с помощью гелевого электрофореза и переносят (метод называется блоттингом ) на нейлоновую мембрану для удобства использования и хранения. При блоттинге Саузерна обычно происходит гибридизация отдельных блотов с меченым зондом, что позволяет идентифицировать ДНК того или иного микроорганизма.
II. Зонды . Зонд представляет собой фрагмент ДНК, отвечающий двум основным критериям. Он должен быть комплементарен к контрольной ДНК и благодаря этому связываться с ней максимально прочно. Кроме того, он должен быть мечен таким образом, чтобы создавать легко определимый сигнал - например, введением радиоактивного фосфата (32Р). Нерадиоактивные зонды могут быть менее чувствительны, чем радиоактивные, зато они безопаснее. Для нерадиоактивного мечения зонда используется биотин, который способен вызывать изменение цвета при соединении с конъюгатом стрептавидин-щелочной фосфатазы; дигоксигенин , вызывающий цветовую или хемилюминесцентную реакцию; или флюоресцентный маркер. Меченые зонды могут использоваться в блотанализе Саузерна, блоты которого изготовлены из геномной ДНК, плазмидной ДНК или ПЦР-продуктов. Мечение зондов является важнейшиим этапом гибридизации in situ .
III. Гибридизация in situ . Хотя гибридизация зонда на нейлоновой мембране со смесью молекул ДНК, выделенных из клинического образца, может идентифицировать определенный микроорганизм, это не является неопровержимым доказательством того, что именно он является причиной заболевания. При гибридизации in situ вместо нейлоновой мембраны в качестве шаблона используется гистологический срез. Сигнал, полученный при использовании меченого зонда, позволяет выявить ДНК или РНК специфического патогена прямо в гистологическом срезе, благодаря чему предварительный диагноз получает свое подтверждение. Эта методика имеет первостепенное значение в иммуногистохимии для диагностики парвовирусного энтерита .
IV. ПЦР (Полимеразная цепная реакция). ПЦР является мощным средством для амплификации точно определенного фрагмента контрольной ДНК. Чтобы быть амплифицированной, контрольная ДНК должна быть специфицирована к двум праймерам ПЦР . Если эти праймеры располагаются на 500 пар оснований дальше от контрольной ДНК, то в результате реакции ПЦР-продукт станет на 500 пар оснований длиннее. Контрольная ДНК подвергается логарифмическому увеличению и удваивается после каждого из 30-40 циклов ПЦР. Уже после 22 циклов количество контрольной ДНК увеличивается в миллион раз. Эти копии контрольной ДНК называются "ампликонами" или "продуктами ПЦР". Каждая реакция должна быть проведена с положительным и отрицательным контролем за ней. Это необходимо для того, чтобы интерпретировать значение любого полученного продукта.
Обнаружение продуктов полимервзной цепной реакции. После электрофореза в агаровом геле ДНК способна флюоресцировать в ультрафиолетовом свете в присутствии этидиума бромида. Подтверждение того, что продукт ПЦР уже имеется в достаточном количестве, является важнейшей частью всего процесса, однако этого недостаточно для постановки диагноза. Продукт ПЦР может быть получен от одной из многих других миллионов молекул ДНК, содержащихся в том же самом образце, причем некоторые из них могут быть аналогичны контрольной цепочке, выделенной в праймеры для гибридизации. Иногда это случайное обстоятельство может создать продукт ПЦР того же самого объема, что и контрольный фрагмент. Поэтому для подтверждения происхождения продукта ПЦР обычно используются специальные тесты. Идентичность продукта можно определить с помощью блотанализа Саузерна, использующего меченый зонд к-ДНК . Кроме того, продукты ПЦР можно классифицировать с помощью рестрикционной эндонуклеазы, чтобы создать специфические образцы фрагментов ДНК для каждого из них. Если при использовании одной из этих методик требуемый продукт ПЦР так и не обнаружен, то это обычно означает, что в начальном образце контрольный фрагмент ДНК отсутствовал. Некоторые варианты ныне используемой стандартной ПЦР будут обсуждаться вместе с теми болезнями, при диагностировании которых они применяются.
