EST: получение из гяРНК
гяРНК представляет собой смесь непроцессированных, частично и полностью процессированных транскриптов, интронов , вырезанных из мРНК в результате сплайсинга и так далее.
Таким образом, можно сказать, что она представляет собой РНК-копию геномной ДНК. Тот факт, что гяРНК содержит интроны, делает ее особенно удобной для выделения человек-специфических последовательностей из гибридных клеток.
Одной из первых работ такого рода была работа Liu с соавт. [ Liu P. e. a., 1993 ]. Авторы использовали гяРНК в качестве матрицы для синтеза кДНК . Полученная гякДНК содержала как экзонные , так и интронные последовательности. Для обогащения гякДНК экзонными последовательностями при синтезе кДНК использовали праймеры , соответствовавшие 5'-консенсусным последовательностям интронов человека (CTTACC, CTCACC, CCTACC, CCCACC). Человек-специфические клоны выделяли путем скрининга полученной библиотеки (800 000 клонов) с тотальной геномной ДНК человека. В результате было выделено 275 человек-специфических клонов. Очевидно, что такой способ получения библиотек чрезвычайно трудоемок.
В 1990 г. Corbo с соавт. [ Corbo L. e. a., 1990 ] предложили более эффективный метод получения человек-специфических библиотек из гибридных клеток. Суть этого подхода заключается в использовании человек-специфических праймеров для синтеза гякДНК. Авторы использовали праймеры TC-65 и 517 , соответствующие консервативным областям Alu-повторов человека . В качестве источника гяРНК использовали гибридные клетки человек-хомяк, содержавшие Xq24-qter район X-хромосомы человека. Было проанализировано более 100 клонов гякДНК. Минимум 80% оказались человек-специфическими, таким образом библиотека была более, чем в 100 раз обогащена человеческим материалом. 8% клонов содержали гякДНК хомяка, происхождение 12% клонов осталось неустановленным. Был проведен более подробный анализ двух клонов, один из которых представлял собой фрагмент гена гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы ( HPRT ) из полосы Xq26 , другой гибридизовался с двумя семействами генов из Xq24- qter . Остальные клоны происходили из ряда сайтов Xq24-qter. Таким образом, было продемонстрировано, что предложенный подход позволяет идентифицировать множество транскрипционно-активных локусов в заданном районе генома.
Следующим этапом в развитии технологии получения хромосом- специфичных гякДНК библиотек была работа Baens с соавт. [ Baens M. e. a., 1993 ]. Авторы сконструировали ранжированную гякДНК библиотеку из гибридных клеток линии M28, содержащих короткое плечо человеческой хромосомы 12 . Первая цепь кДНК с гяРНК была синтезирована с помощью праймера RT , содержавшего случайный гексануклеотид на 3'-конце. Для увеличения человек-специфичности полученной библиотеки была проведена специфическая PCR- амплификация человеческих последовательностей с помощью праймеров RT и одного из Alu-специфических праймеров ( праймера 517 в случае одной из библиотек и праймера TC-65 - в случае другой). Продукты PCR-амплификации были клонированы и полученные библиотеки ранжированы. По оценкам авторов число независимых клонов в библиотеках составляло около 550. Около 80% клонов происходили из плеча 12p хромосомы человека. Проведенная проверка показала, что все клоны происходят из транскрибирующихся последовательностей. Ряд случайно выбранных клонов был проверен с помощью Саузерн- и Нозерн-блотов , секвенирования и PCR-амплификации. Из 60 гякДНК клонов 6 дали сигналы на Нозерн-блотах, в 3 случаях была выделена соответствующая кДНК (в случае клона CD60A1 - катион-зависимого рецептора маннозы; клона CC6 - человеческого гомолога кодируемой ядром субъединицы NADH:убихинон оксидоредуктазы массой 39 кД; в случае клона CD18 - одного из членов семейства генов фактора некроза опухолей).
Необходимо отметить, что примененная авторами схема клонирования не позволила добиться существенного увеличения человек-специфичности полученной библиотеки.
Для повышения человек-специфичности получаемых библиотек гякДНК в лаборатории Е.Д. Свердлова ИБХРАН была разработана новая схема получения таких библиотек [ Вагнер Л.Л., 1994 ], [ Обрадович Д. и др., 1994 ].
гяРНК, синтезированная с человеческой хромосомы в гибридной клетке отличается от гяРНК, синтезированной с хромосом хомяка, наличием Alu- повторов (R на рис. 1. ). Это позволяет проводить синтез человек - специфичной гякДНК с помощью праймеров, соответствующих фрагментам последовательности человек - специфических повторов (праймер Е на рис. 1. ). К 3'-концу полученной первой цепи гякДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидтрансферазы добавляли олиго(dC) последовательность и проводили первый раунд PCR с праймерами EC(5'GAATT(C203') и праймера Е . Оба эти праймера содержат сайты узнавания рестриктазы EcoRI . Во втором раунде PCR использовали праймеры ЕС и праймер В , характеризующийся двумя особенностями. Во-первых, его 5'-концевая часть перекрывается с 3'-концевой частью праймера Е, во-вторых, он содержит сайт узнавания рестриктазы BamHI . Таким образом, продукт второго раунда PCR отличается от продукта первого раунда тем, что он содержит на концах сайты узнавания двух рестриктаз, что позволяет специфически клонировать его в соответсвующий вектор.
Благодаря применению двух раундов PCR и направленного клонирования продуктов второго раунда удалось значительно повысить специфичность клонирования человек-специфичной гякДНК.
Приведенная схема позволила добиться существенно большей человек-специфичности библиотек гякДНК. По нашим оценкам человек-специфичность полученных библиотек превышает 98% (из проанализированных 89 клонов только 1 оказался хомяк-специфичным и 1 оказался фрагментом одного из рибосомных белков E. coli.
Рис. 1. Общая схема получения библиотеки кДНК (по [ Вагнер Л.Л., 1994 ], [ Обрадович Д. и др., 1994 ]). R - повторяющиеся человек-специфичные последовательности (в данном случае - Alu). E - сайт узнавания EcoRI, B - BamHI.
