Подготовка диагностической пробы твердой опухоли
Если предполагается, что собранная проба будет использована для генетического анализа, либо для дополнительных клинических анализов, либо для научных целей, лучше стерильным скальпелем разделить свежевыделенную опухоль на две равные части. Частички опухоли, отрезанные от внешней видимой клеточной области одной половины данной пробы, быстро замораживают в жидком азоте, а аналогичные кусочки другой половины готовят для гистологического исследования.
В лаборатории замороженные пробы ткани быстро оттаивают. Количество ДНК будет увеличено, если вначале пробы как можно больше измельчить и раскрошить ткани. Эту процедуру измельчения надо произвести как можно быстрее на холодной поверхности, чтобы свести к минимуму деградацию ДНК присутствующими нуклеазами.
При анализе тканей на ДНК часто бывает важно знать, что анализ на ДНК производится на соответствующем участке ткани. Одним из способов убедиться, что данная ткань подходит для анализа, является быстрое замораживание ткани в жидком азоте. Перед анализом на ДНК следует отрезать от ткани тонкий срез толщиной 6 мкм и окрасить его гемоксилином и эозином. Отправьте данную пробу патологу на анализ, чтобы при помощи световой микроскопии убедиться, что данная ткань содержит интересующие вас клетки.
Ретроспективный анализ ДНК часто проводится с использованием фиксированных тканей, поскольку часть клеточной ДНК остается нетронутой в тканях, фиксированных путем заливки парафином, методом проточной цитометрии или гибридизационными исследованиями in situ . Благодаря возможности проводить генетический анализ на фиксированных формалином тканях исследователи получили доступ к огромным архивным источникам хорошо охарактеризованных тканей. Доказана возможность использования архивных тканей десятилетней давности для ПЦР . ДНК, полученные из фиксированных тканей, обычно обладают меньшей эффективностью для молекулярного анализа, чем очищенная ДНК или ДНК, полученная из необработанных фрагментов свежих тканей. Лучшим фиксирующим средством для ретроспективного ДНК анализа служит нейтральный буферный раствор формалина, хотя 25-50% проб, фиксированных в формалине, не дают хорошую ДНК с высоким молекулярным весом. После фиксации в метаноле или этаноле ткани также содержат экстрагируемую ДНК. И даже мазки крови, высушенные воздушным путем и окрашенные по методу Романовского, и костный мозг могут также служить источниками ДНК. В тканях, фиксированных в формалине, вызванная фиксацией деградация ДНК происходит главным образом из-за структурирующих ДНК протеинов. Другие фиксирующие растворы, содержащие ртутную кислоту, такие как В5 и раствор Зенкера, приводят к более интенсивной деградации ДНК.
Экстракция ДНК из фиксированных тканей происходит параллельно с методами, применяемыми для экстракции ДНК с высоким молекулярным весом из свежих тканей. Однако следует помнить, что экстракция ДНК из тканей на самом деле представляет ДНК, получаемую из гетерогенного сбора различных типов клеток и фенотипов, а ДНК, полученная путем экстракции, представляет средний фенотип. При этом теряются все пространственные взаимосвязи и тонкие различия в клеточных фенотипах, которые обычно имеют решающее значение для гистологической диагностики.
Время фиксации оказывает влияние на ДНК, полученную в результате экстракции. Время фиксации влияет также на способность к увеличению количества ДНК. При фиксации тканевой пробы в нейтральном буферном растворе формалина до 24 часов происходит увеличение полученной ДНК, но при фиксации в течение более длительного времени происходит сокращение выхода конечного продукта. Кроме того, продолжительность хранения тканевых блоков также влияет на результаты. Несмотря на то, что ДНК продолжают получать из тканей, которые хранились в парафине в течение пяти и более лет, размеры ДНК-фрагментов, полученных из блоков, хранившихся два и более лет, были меньше, чем ДНК-фрагменты, полученные из блоков возрастом менее двух лет.
Использование микродиссектированных архивных материалов (тканей, диссектированных с предметных стекол) имеет свои недостатки; проблема заключается в малых размерах проб и плохом качестве ДНК. Деградированная ДНК, полученная из тканей после фиксации, обычно представляет собой смесь фрагментов с размерами от 100 до 2400 пар нуклеотидов (bp). Но в некоторых случаях ДНК бывает настолько деградированной, что ее уже нельзя применять для некоторых методов, например, для Саузерн-гибридизации или ПЦР . Одним из путей решения проблемы деградации ДНК для ПЦР является увеличение коротких областей, в которых содержится менее 200 пар нуклеотидов. Другая сложность заключается в том, что олигонуклеотидные праймеры обычно предназначаются для анализа геномной ДНК, а не проб, фиксированных в парафине. Необходимо определить, насколько хорошо эти олигонуклеотиды будут взаимодействовать с архивным материалом. Если проблема будет заключаться в деградации ДНК и ее малом количестве, может понадобиться применение гнездовых праймеров. При данном методе сначала происходит увеличение количества ДНК, что способствует небольшой выработке конкретного продукта, который обычно трудно обнаружить на гелях, окрашенных бромидомом этида. Небольшое количество этого первоначального продукта, полученного при ПЦР, затем увеличивается в ходе второй стадии увеличения, чему способствуют праймеры, проводящие гибридизацию на участках внутри первоначальной серии.
Общий метод экстракции ПЦР из залитых парафином тканей состоит в убирании воска и очищении ДНК при помощи переваривания протеиназы R, после чего следует экстракция фенол-хлороформом. Целью данного метода является получение качественной ДНК, дважды спирализованной, с высоким молекулярным весом и расщепленной эндонуклеазой.
