Физиологическая роль КК
В проанализированных выше работах основной упор был сделан на поиск оптимальных условий для проявления активности мт-КК. По существу, постулированная прямая передача АН между активными центрами мт-КК и ТАН используется для того, чтобы объяснить эффективный синтез КФ с помощью мт-КК. Однако окислительное фосфорилирование - это первичный процесс запасания энергии, и в связи с этим важно знать, какова роль мт-КК в обеспечении эффективного синтеза АТР митохондриями. КК присутствует по обе стороны от наружной мембраны митохондрий, поэтому было высказано предположение, что перенос Кр из цитоплазмы в межмембранное пространство может рассматриваться как непрямой перенос ADP - субстрата окислительного фосфорилирования и что в этом непрямом переносе ADP заключается главная функция мт-КК [ Nicolay, ea 1998 , Van_Dorsten, ea 1998 , Gellerich. ea 2000 ].
Известно, что асинхронные летательные мышцы насекомых , характеризующиеся высокой скоростью сокращения и высоким уровнем аэробного обмена, содержат эволюционный предшественник КК - аргининкиназу - только в цитоплазме, но не в митохондриях [ Sactor. ea 1954 , Lewis. ea 1962 , Wyss, ea 1995 ]. Висе и соавт. объясняют этот факт тем, что в летательных мышцах много митохондрий и диффузионные расстояния невелики [ Wyss, ea 1995 ]. Между тем диаметр фибрилл в асинхронных мышцах насекомых (2 мкм) [ Smith. ea 1963 ] не меньше диаметра фибрилл в сердце (1-2 мкм) [ Meyer, ea 1984 ], а содержание митохондрий в них (40% v/v) [ Smith. ea 1963 ] не намного больше, чем в сердце (22-37%) [ Ventura-Clapier, ea 1994 ] (до 40% в случае маленьких животных [ Ventura-Clapier, ea 1998 ]). Кроме того, скорость продукции энергии (QО2 Р/O) митохондриями летательных мышц сравнима со значениями, полученными для сердечных митохондрий [ Gregg, ea 1960 , Childress. ea 1966 ]. Содержание АН в этих мышцах находится в пределах, найденных для возбудимых тканей позвоночных [ Sactor, ea 1966 , Beis, ea 1975 ]. В то же время в физиологических условиях Kкаж аргининкиназной реакции [ Rao, ea 1976 ] в направлении синтеза АФ примерно в 10 раз больше Ккаж для креатинкиназной реакции [ Lawson, ea 1979 ], а отношение АФ/Ар ниже, чем отношение КФ/Кр в мышцах позвоночных [ Beis, ea 1975 ]. Аргининкиназная реакция в покое в летательных мышцах находится в состоянии равновесия [ Beis, ea 1975 ]. Все это позволяет предположить, что в состоянии покоя концентрация свободного ADP в асинхронных летательных мышцах может быть в несколько раз выше, чем в мышцах позвоночных. Во время полета эта концентрация еще возрастает [ Sactor, ea 1966 ]. Вероятно, отсутствие аргинин киназы в митохондриях летательных мышц может быть объяснено именно существованием в этих мышцах относительно высокой концентрации свободного ADP в цитоплазме, при которой отпадает необходимость в митохондриальном изоферменте аргининкиназы. Известно, что в летательных мышцах скорость окислительного фосфорилирования регулируется главным образом не концентрацией ADP, а зависит от активности ряда дегидрогеназ, которые активируются при переходе от покоя к сокращению [ Sactor, ea 1970 ]. Имеются также специальные механизмы, позволяющие преодолеть ннгибнрующий эффект высокой концентрации ADP на АТРазу актомиозина [ Biosca, ea 1990 ]. Возможно, что именно различия в положении равновесия двух реакций послужили причиной эволюционной замены аргининкиназы на КК. Креатинкиназная реакция может обеспечить более высокое отношение ATP/ADP и более высокий фосфорильный потенциал в цитоплазме, чем аргининкиназная реакция. Таким образом, замена аргининкиназы на КК, с одной стороны, дает огромное преимущество, так как КК может поддерживать отношение ATP/ADP в цитоплазме на высоком уровне, но, с другой стороны, возникает новая проблема, так как концентрация ADP в цитоплазме низка, а наружная мембрана митохондрий обладает ограниченной проницаемостью. Вероятно, появление мт-КК в межмембранном пространстве митохондрий позволило разрешить это противоречие. На рис. 4 приведена схема функционирования мт-КК, которая логически вытекает из всего сказанного выше. Поскольку градиент, создаваемый наружной мембраной, лежит в области микромолярных концентраций, концентрации трех субстратов КК: АТР, КФ и Кр - в межмембранном пространстве митохондрий в любой момент времени фактически не должны отличаться от их концентрации в цитоплазме. В цитоплазме скелетных мышц и сердца Креатинкиназная реакция близка к состоянию равновесия в широком диапазоне условий [ Ugurbil, ea 1986 , Meyer, ea 1984 , Mattews, ea 1982 ]. Это означает, что мт-КК не может создать в межмембранном пространстве концентрацию четвертого субстрата, ADP, выше той равновесной концентрации, которая существует в данный момент в цитоплазме. Чем ближе мт-КК к состоянию равновесия, тем ближе концентрация ADP в межмембранном пространстве к концентрации ADP в цитоплазме. Таким образом, представляется, что специфическая функция мт- КК заключается в быстром уравновешивании концентрации ADP и, следовательно, отношения ATP/ADP, в межмембранном пространстве с теми величинами, которые существуют в данный момент в цитоплазме [ Липская ea 2000 ]. Так как эта система работает без усиления, то благодаря активности мт-КК система окислительного фосфорилирования получает неискаженную информацию о текущей величине фосфорильного потенциала в цитоплазме. В биоэнергетической модели, описывающей события цикла сокращения и расслабления в мышце, такой механизм обратной связи является достаточным для поддержания энергетического баланса [ Jeneson, ea 1996 , Kushmerick, ea 1998 ]. В то же время при низкой концентрации ADP в мышечных клетках, ADP, присутствующий в межмембранном пространстве, должен стимулировать дыхание митохондрии в гораздо большей степени, чем оно было бы стимулировано в присутствии такой же концентрации ADP в цитоплазме и при отсутствии активности мт-КК (за счет того, что КmADP для собственно ТАН должна быть ниже, чем КmADP для митохондрии, на величину которой влияет относительная непроницаемость наружной мембраны). При физиологических значениях рН максимальная активность мт-КК всего в 2-3 раза превосходит максимальную скорость окислительного фосфорилирования [ Lipskaya. ea 1995 , Saks, ea 1980 ]. Возможно, что олигомерные формы мт-КК, различающиеся по своим кинетическим свойствам [ Lipskaya. ea 1989 ], нужны для того, чтобы поддерживать креатин-киназную реакцию в митохондриях в близком к равновесию состоянии в широком диапазоне условий. Можно рассчитать, что максимальная скорость потребления кислорода тканью сердца равна 49-56 мкг-ат О/мин на 1 г сырой ткани. Потребление кислорода сердцем без нагрузки составляет порядка 4 мкг-ат О/мин на 1 г ткани [ Balaban, ea 1989 ], т.е. меньше 10% от максимально возможного. При средних нагрузках сердце крысы потребляет 12-23 мкат О/мин на 1 г сырого веса [ Kingsley-Hickman, ea 1987 ], что составляет 25-40% от максимально возможной скорости дыхания, которая достигается только в состоянии стресса. Было найдено, что при средних нагрузках, когда коронарный кровоток не лимитирует поступление субстратов, увеличение скорости дыхания ткани сердца в 2-3 раза не сопровождается изменениями в цитоплазме концентрации участников креатинкиназной реакции [ Balaban, ea 1989 , Katz, ea 1989 ], которая находится в состоянии, близком к равновесному. Можно предположить, что в этих условиях и мт-КК находится в близком к равновесию состоянии. О близком к равновесному состоянию мт-КК in vivo свидетельствуют опыты с [31Р]ЯМР на мышах, генетически лишенных ММ-КК [ Nicolay, ea 1998 , Van_Dorsten, ea 1998 ]. В то же время при максимальных нагрузках, вероятно. возможно отклонение креатинкиназной реакции как в митохондриях, так и в цитоплазме, от положения равновесия [ Saks, ea 1996 , Aliev, ea 1997 , Saks, ea 2000 ], хотя даже при нагрузках, близких к максимальным, разница в содержании метаболитов между систолой и диастолой наблюдается только при перфузии сердца глюкозой, но не пируватом [ Wikman-Coffelt, ea 1983 ]. По расчетам Кушмерика, отклонение креатинкиназной системы от равновесия в быстрых скелетных мышцах даже при максимальных нагрузках очень невелико и кратковременно [ Kushmerick, ea 1998 ]. Всякое значительное отклонение креатинкиназной реакции от положения равновесия означает резкое снижение эффективности ее как энергетического буфера, так как только при равновесии, когда дельтаG = 0, обмен фосфорилом между АТР и КФ происходит без потерь энергии системой. С другой стороны, при максимальных нагрузках, если увеличивается содержание свободного ADP в цитоплазме, то разница в концентрации ADP между цитоплазмой и межмембранным пространством должна относительно уменьшаться [ Gellerich, ea 1994 ] и должна снижаться роль мт-КК в процессе их выравнивания. Возможно, что физиологическая роль других КК, связанных с внутриклеточными структурами в местах потребления АТР, также заключается в быстром уравновешивании локальных концентраций ADP, возникающих в соответствующих компартментах в процессе функционирования этих АТРаз, с концентрацией ADP в цитоплазме. С этой точки зрения появление локальных КК является адаптационным приспособлением к сложной структурной организации белков в клетке, создающей внутри некоторых белковых комплексов дополнительные диффузионные ограничения, которые становятся существенными для веществ, присутствующих в клетке в низкой концентрации. Как и в случае с мт-КК. чем ближе локальные креатинкиназные реакции к состоянии равновесия, тем более эффективно осушествляют они свою функцию. Для миофибрилл скелетных мышц отношение КК : миозин равно 1 : 40 [ Wallimann, ea 1985 ], а в миофибриллах сердца это отношение может достигать величины 1 : 10 [ Ventura-Clapier, ea 1987 ]. В то же время активность КК в миофибриллах сердца крысы превосходит АТРазную активность примерно в 8 раз [ Ventura-Clapier, ea 1994 ], а в быстрой мышце цыпленка -в 2,3 раза [ Ventura-Clapier, ea 1994 ]. Таким образом, в миофибриллах можно видеть проявление того же принципа. что и в митохондриях: количество молекул КК много меньше, чем число молекул миозина (число молекул ТАН в митохондриях), а удельная активность КК - много выше. Из приведенной модели следует также, что мт-КК, растворимая КК цитоплазмы н ММ-КК, связанная со структурами, функционируют не независимо одна от другой, как это предполагает гипотеза о транспортной функции креатинкиназной системы, а находятся в постоянном взаимодействии.
Можно ли считать, что все аспекты функции креатинкиназной системы уже изучены? Из проведенного анализа видно, что это не так. В первую очередь это касается мт-КК. Не ясна роль мт-КК в контактных участках, не ясна роль олигомерных форм и возможность их взаимных переходов в нативных митохондриях. Изучение креатинкиназной реакции, а также других периферических киназных реакций митохондрий может дать важную информацию о компартментации нуклеотидов в межмембранном пространстве и физиологическом значении этого явления [ Laterveer, ea 1997 ]. Важная информация может быть получена при изучении креатинкиназной системы в немышечных тканях и клетках [ Wallimann, ea 1994 ], в частности, в мозге , КК цитоплазмы и митохондрий которого представлена иными, чем в мышцах, изоформами [ Eder, ea 1999 , Schlegel, ea 1998 ], а также в мышечных клетках разных видов животных, стоящих на разных ступенях эволюции [ Ventura-Clapier, ea 1998 ]; при разных патологических состояниях [ O'Gorman, ea 1997 , Soboll, ea 1999 , Neubauer, ea 1999 , De_Sousa, ea 1999 ], при сопоставлении функций КК и ее эволюционного предшественника - аргининкиназы [ Newsholme, ea 1978 , Eder, ea 1999 , Davuluri, ea 1981 ], а также в результате использования методов генной инженерии и ЯМР [ Nicolay, ea 1998 , Van_Dorsten, ea 1998 , Koretsky, ea 1995 , Veksler, ea 1995 ].
