Афинность и специфичность аптамеров
В большинстве экспериментов в результате отбора удается получить аптамеры, взаимодействующие со своими мишенями с очень высокой афинностью. Белки являются наилучшими мишенями для отбора аптамеров, и константы диссоциации (Кд) комплексов аптамеров с белковыми мишенями обычно лежат в наномолярном и субнаномолярном диапазоне (от 10 в степени минус 11 до 10 в степени минус 9 М). В случае различных низкомолекулярных мишеней Кд обычно составляют от 10 в степени минус 6 до 10 в степени минус 7 М ( Gold et al., 1995 ). Более высокое сродство аптамеров к белковым мишеням, вероятно, объясняется тем, что в таких комплексах больше площадь контакта аптамера с молекулой-мишенью ( Eaton et al., 1995 ).
Кроме высокой афинности, аптамеры также обычно обладают большой специфичностью к молекуле-мишени. Было предположено, что отбор на высокое сродство к мишени автоматически приводит к идентификации высокоспецифичных лигандов ( Eaton et al., 1995 ). Это связано с тем, что наиболее аффинные лиганды, как правило, имеют большую (ударение на первый слог) площадь взаимодействий с мишенью и образуют с ней очень плотные "комплементарные" контакты. В результате даже минимальные изменения поверхности мишени (в случае близкородственных белков) могут значительно ослаблять взаимодействия с аптамером.
Вместе с тем, способность аптамеров различать похожие белки в каждом конкретном случае, видимо, определяется тем, в каком участке белка-мишени происходит связывание. Если аптамер связывается с вариабельным районом белковой молекулы, то взаимодействие будет более специфичным, чем при связывании с консервативным районом, так как в первом случае узнаваемый эпитоп будет сильнее отличаться даже у родственных белков. Соответственно, уровень гомологии белков, определяющий границу специфичности аптамеров, может различаться в разных случаях. Так, аптамеры к белку Rev вируса HIV-1 узнают также белок вируса HIV-2, хотя эти белки идентичны всего на 65% ( Yamamoto et al., 2000b ). В то же время, аптамеры к протеин-киназе С не взаимодействуют с близкородственной изоформой фермента, отличающейся всего на 4% ( Conrad et al., 1994 ). При анализе аптамеров к тромбину ( Tsiang et al., 1995 ), репликазе вируса гепатита С ( Biroccio et al., 2002 ), обратной транскриптазе вируса HIV-1 ( Fisher et al., 2002 ) были получены точечные мутации в белке-мишени, которые приводили к значительному ухудшению связывания аптамера с мишенью (Кд (константа диссоциации) комплексов увеличивалась более чем в 100 раз). Таким образом, можно сделать вывод, что аптамеры способны различать белки, отличающиеся единственной аминокислотной заменой.
Специфичность аптамеров к белку-мишени можно регулировать в процессе отбора. Так, если требуется получить аптамер, обладающий очень высокой специфичностью, то в ходе SELEX необходимо отбирать последовательности, связывающиеся с белком-мишенью, но не взаимодействующие с другим, близкородственным белком. Напротив, если необходимо получить аптамер, способный узнавать несколько родственных белков (например, белки-ортологи из разных организмов), то при проведении эксперимента отбирают последовательности, способные связываться с несколькими белками-мишенями (данная процедура получила название toggle-SELEX, от англ. toggle - переключать, ( White et al., 2001 )).
