Эпитопы, узнаваемые аптамерами
Аптамеры к белкам, как и антитела, узнают специфические участки поверхности мишени, которые получили название эпитопов. Считается, что большинство аптамеров узнают структурированные эпитопы на белках-мишенях ( Eaton et al., 1995 ; Gold et al., 1995 ; Petach and Gold, 2002 ). Так как при отборе аптамеров в качестве мишени обычно используют полноразмерные белки, находящиеся в нативном состоянии, то в состав эпитопа, узнаваемого аптамерами, могут входить несколько участков белка, сближенных в трехмерной структуре. Это отличает аптамеры от антител, которые селектируются в организме на связывание с достаточно короткими фрагментами процессированного белка-мишени. Тем не менее, известны примеры аптамеров, способных узнавать короткие пептиды ( Xu and Ellington, 1996 ) и денатурированные белки ( Bianchini et al., 2001 ).
Вероятно, в этих случаях взаимодействие происходит по принципу индуцированного сродства, и при связывании с аптамером пептид приобретает определенную конформацию ( Fitter and James, 2005 ; Hermann and Patel, 2000 ; Xu and Ellington, 1996 ). Анализ большого числа экспериментов показывает, что в ходе отбора один эпитоп белка-мишени может стать доминантным при наличии многих других потенциальных сайтов связывания олигонуклеотидов. Было обнаружено, что даже при наличии существенных различий в нескольких экспериментах по отбору аптамеров полученные лиганды часто имеют общую структуру и связываются с одним и тем же эпитопом белка-мишени. Одним из наиболее ярких примеров может служить отбор аптамеров к обратной транскриптазе вируса HIV-1. В трех независимых экспериментах были использованы три различные РНК-библиотеки и разные схемы отбора ( Burke et al., 1996 ; Tuerk et al., 1992 ).
Тем не менее, во всех случаях подавляющее большинство отобранных последовательностей формировало один и тот же класс аптамеров, имеющих структуру псевдоузла (см. " Структурные особенности аптамеров "), и связывающихся в области природного РНК-связывающего центра фермента. В другом эксперименте было обнаружено, что использование в качестве мишени для отбора аптамеров изолированного рибосомного белка S1, целой 30S-субчастицы рибосомы, а также репликазы фага Qбета приводит к выявлению одного и того же класса аптамеров, которые взаимодействуют с белком S1, входящим в состав всех трех мишеней ( Brown and Gold, 1995 ; Ringquist et al., 1995 ).
Оказалось, что часто даже разные классы аптамеров, отличающиеся по последовательности и трехмерной структуре, также связываются с одинаковыми или перекрывающимися эпитопами белка-мишени. В качестве примера можно привести аптамеры к обратной транскриптазе вируса HIV-1 ( Chen and Gold, 1994 ; Schneider et al., 1995 ), к ДНК-полимеразе T. aquaticus ( Dang and Jayasena, 1996 ), фактору элонгации трансляции EF-Tu ( Dang and Jayasena, 1996 ), РНК-полимеразе E. coli ( Kulbachinskiy et al., 2004 ) и многие другие. Таким образом, можно сделать вывод, что один и тот же эпитоп белка способен связывать несколько аптамеров, обладающих различной последовательностью и, вероятно, вторичной и третичной структурой. Стоит отметить, что в случае РНК- и ДНК-связывающих белков аптамеры обычно связываются в естественных сайтах связывания нуклеиновых кислот ( Dang and Jayasena, 1996 ; Kulbachinskiy et al., 2004 ; Tuerk et al., 1992 ). Данный феномен, вероятно, можно объяснить асимметричным распределением зарядов по поверхности белков: как правило, участки молекулы, взаимодействующие с РНК или ДНК, несут частичный положительный заряд, в то время как вся остальная поверхность является нейтральной или заряжена отрицательно ( Darst, 2001a ; Tuerk et al., 1992 ).
Эффект доминирования одного (или очень небольшого числа) эпитопов наиболее ярко проявляется при отборе аптамеров к так называемым сложным мишеням (complex targets), которые содержат большое количество разных белков. В качестве примеров можно привести эксперименты по отбору аптамеров к вирусным частицам ( Pan et al., 1995 ), клеткам трипаносом ( Homann and Goringer, 1999 ), мембранам эритроцитов ( Morris et al., 1998 ), культурам клеток ( Cerchia et al., 2005 ; Hicke et al., 2001 ), плазме крови ( Fitter and James, 2005 ), кровеносным сосудам ( Blank et al., 2001 ) и др. Во всех перечисленных случаях в результате отбора было получено лишь несколько классов аптамеров, несмотря на наличие многих тысяч различных белковых мишеней. Так, аптамеры, полученные к клеткам глиобластомы, оказываются специфичны к белку внеклеточного матрикса TN-C (tenascin-C) ( Hicke et al., 2001 ). Мишенью аптамеров к трансформированным эндотелиальным клеткам является белок pigpen ( Blank et al., 2001 ). В случае отбора аптамеров к белкам плазмы крови большая часть лигандов оказывается специфична к протромбину ( Fitter and James, 2005 ). При отборе аптамеров к активированным нейтрофилам получены лиганды, узнающие экспонированную на мембране нейтрофилов эластазу и имеющие ту же структуру, что и аптамеры, полученные ранее к изолированной эластазе ( Charlton et al., 1997a ).
Эффект доминирования при отборе ограниченного числа различных эпитопов, по-видимому, объясняется самой природой отбора in vitro, в ходе которого осуществляется преимущественная амплификация небольшого числа последовательностей, которые с наибольшей эффективностью связываются с мишенью, в то время как остальные последовательности постепенно исключаются из библиотеки. Действительно, при анализе динамики отбора аптамеров к белкам плазмы крови человека было обнаружено, что на начальных стадиях отбора в обогащенной библиотеке присутствуют аптамеры ко многим белкам плазмы, в то время как при дальнейшем проведении отбора количество разных классов аптамеров значительно сокращается ( Fitter and James, 2005 ). Таким образом, сокращение числа раундов при отборе может приводить к выявлению большего числа разных классов аптамеров. С этой точки зрения, наиболее перспективным является разработанный метод отбора аптамеров при помощи капиллярного электрофореза, который позволяет получать высокоаффинные аптамеры в одну стадию, без проведения амплификации библиотеки ( Berezovski et al., 2005 ; Berezovski et al., 2006 ).
