Методы отбора аптамеров: используемые библиотеки
I. Классические библиотеки.
В большинстве экспериментов по отбору аптамеров используют библиотеки, содержащие случайный район длиной 20-60 нт (в некоторых случаях от 8 до 220 нт). Было предположено, что использование библиотек с более длинным случайным районом может способствовать более эффективному отбору аптамеров, так как более длинные последовательности способны формировать большее разнообразие различных структур ( Conrad et al., 1996 ). В то же время, количество ДНК или РНК, используемое при отборе, обычно составляет от 10 в степени минус 8 до 10 в степени минус 10 М, или от 10 в 14-ой степени до 10 в 16-ой степени молекул, что соответствует общему количеству различных вариантов последовательностей для олигонуклеотида длиной 25 нуклеотидов (приблизительно 4 в степени 25 - 10 в степени 15). Таким образом, библиотеки со случайным районом длиннее 25 нт. являются сильно недопредставленными и содержат такое же число разных вариантов последовательностей, что и более короткие библиотеки. Действительно, при отборе аптамеров к обратной транскриптазе вируса HIV-1 при использовании РНК-библиотек со случайным районом длиной 32, 70 и 80 нт. были получены аптамеры одинаковой структуры ( Burke et al., 1996 ; Tuerk et al., 1992 ). Более того, в эксперименте по отбору аптамеров к изолейцину было показано, что при увеличении длины случайного района больше 70 нт происходит уменьшение эффективности отбора аптамеров ( Legiewicz et al., 2005 ).
В различных экспериментах SELEX используются как РНК, так и оцДНК библиотеки. Анализ большого числа различных аптамеров показывает, что оцДНК-аптамеры по своей аффинности и специфичности не отличаются от РНК- лигандов ( Breaker, 1997 ). Преимущество РНК-аптамеров заключается в том, что они могут быть экспрессированы внутри клеток, что может иметь важное значение при проведении исследований in vivo. В то же время, ДНК- аптамеры обладают большей стабильностью в широком диапазоне условий. В связи с этим ДНК-аптамеры получают в последнее время все более широкое распространение ( Breaker, 1997 ).
II. Библиотеки с фиксированной структурой (structurally constrained libraries).
В некоторых экспериментах при отборе используют библиотеки с заданной вторичной структурой. В этом случае случайный район (иногда несколько участков, разделенных фиксированными последовательностями) помещается между фиксированными последовательностями, способными формировать определенную вторичную структуру (шпильку, G-квартет, псевдоузел). Данный прием используется в том случае, если известно, какую вторичную структуру РНК или ДНК способен узнавать белок-мишень, или для увеличения общей стабильности отбираемых аптамеров ( Biroccio et al., 2002 ; Hamm, 1996 ; Hamm et al., 2002 ; Hamm et al., 1997 ; Tuerk and Gold, 1990 ).
III. Библиотеки на основе известной последовательности.
Библиотеки данного типа содержат случайный район на основе какой- либо известной последовательности (например, полученного ранее аптамера), но при синтезе каждой позиции этого района кроме нуклеотида, соответствующего исходной последовательности, используют также небольшое количество остальных трех нуклеотидов (от 1% до 30%). Это позволяет получить библиотеку олигонуклеотидов, в различной степени похожих на исходную последовательность (т.н. doped library, от англ. dope - примесь). Проведение отбора с использованием данной библиотеки позволяет выявить различные варианты исходной последовательности, способные взаимодействовать с молекулой-мишенью. Данный подход применяется для оптимизации связывания полученных ранее последовательностей, а также для выявления нуклеотидов аптамера, которые наиболее важны для связывания ( Burke et al., 1996 ; Hirao et al., 2004 ; Knight and Yarus, 2003 ).
IV. Библиотеки, не содержащие фиксированных последовательностей.
Данные библиотеки используют для минимизации размеров аптамера. Во многих случаях участки фиксированных последовательностей исходной библиотеки необходимы для формирования правильной структуры аптамера и их удаление нарушает связывание с молекулой-мишенью. Для получения аптамеров, не включающих в свой состав фиксированных последовательностей и, таким образом, имеющих меньшие размеры, был предложен метод tailored SELEX (от англ. tailor - шить, сшивать). В этом случае при отборе используют библиотеку, содержащую очень короткие фиксированные участки (4-6 нт) по обеим сторонам от случайного района. После каждого раунда отбора к ним при помощи реакции лигирования присоединяют адапторные последовательности, которые используют для амплификации, а перед проведением следующего раунда отбора удаляют ( Vater et al., 2003 ).
V. Библиотеки на основе геномных последовательностей ( genomic SELEX ).
Данные библиотеки используют для поиска сайтов связывания различных белков с геномными последовательностями ДНК и РНК (например, в случае факторов транскрипции, сплайсинга, регуляторов трансляции) ( Gold et al., 1997a ; Shtatland et al., 2000 ). Для создания таких библиотек геномную ДНК фрагментируют на достаточно короткие участки (50- 500 нт.) и присоединяют к ним участки фиксированной последовательности. При анализе последовательностей РНК в один из фиксированных участков вносят последовательность Т7-промотора. Дальнейший отбор последовательностей, связывающихся с белком-мишенью, проводят стандартными методами.
