Элементы РНКП, необходимые для узнавания GGGA-содержащих промоторов
Структурные элементы РНК-полимеразы (РНКП), необходимые для узнавания GGGA-содержащих промоторов.
Несмотря на то, что сигма-субъединицы РНКП T. aquaticus и E. coli узнают GGGA-элемент с одинаковой специфичностью, только РНКП T. aquaticus способна к инициации транскрипции на GGGA-содержащих промоторах в отсутствие -35 элемента. Очевидно, что способность узнавать такой тип промоторов должна определяться не только специфическими взаимодействиями сигма с GGGA, но и другими свойствами РНКП.
Ранее было показано, что в узнавание промоторов РНКП E. coli могут вносить вклад неспецифические взаимодействия C-концевых доменов альфа- субъединиц РНКП (альфаCTD) и района 4 сигма70-субъединицы с промоторной ДНК ( Рис. 2.1 ) ( Davis et al., 2005 ; Minakhin and Severinov, 2003 ; Ross and Gourse, 2005 ). В частности, было установлено, что контакты альфаCTD с ДНК в участке левее -35 элемента стимулируют узнавание промоторов РНКП E. coli даже в отсутствие UP-элемента ( Davis et al., 2005 ; Ross and Gourse, 2005 ). Контакты района 4 сигма70- субъединицы с ДНК в области -35 элемента вносят вклад в узнавание промоторов, не содержащих -35 элемента ( Minakhin and Severinov, 2003 ). Кроме того установлено, что контакты района 4 сигма-субъединицы с ДНК зависят от взаимодействий данного домена с доменом flap ("заслонка") бета-субъединицы РНКП ( Kuznedelov et al., 2002b ; Minakhin and Severinov, 2003 ). В частности показано, что удаление домена бетаflap в РНКП E. coli нарушает узнавание -35 элемента в Т7A1-промоторе районом 4 сигма-субъединицы. На основании этого сделано предположение, что домен бетаflap необходим для эффективного узнавания -35 элемента ( Kuznedelov et al., 2002b ). Возможно, что домен бетаflap может также стимулировать неспецифические взаимодействия района сигма4 с ДНК на промоторах, не содержащих -35 элемента.
Для анализа возможной роли доменов альфаCTD, сигма4 и бетаflap РНКП T. aquaticus в узнавании GGGA-содержащих промоторов исследованы мутантные варианты РНКП с делециями этих доменов (дельта альфаCTD, дельта сигма4 и дельта бетаflap). Обнаружено, что все три мутантные РНКП не способны к инициации транскрипции на sTap2-промоторе. В то же время, все исследованные РНКП обладают высокой активностью на контрольном промоторе galР1. Следовательно, мутации не приводят к полной инактивации РНКП и их эффект на транскрипцию является промотор- специфическим ( Рис. 3.4 ).
Таким образом, домены альфаCTD, сигма4 и бетаflap РНКП T. aquaticus необходимы для узнавания GGGA-содержащих промоторов (в частности, sTap2) в отсутствие -35 элемента. Можно предположить, что роль исследуемых доменов заключается в стимуляции связывания РНКП с промотором за счет неспецифических взаимодействий с ДНК в области, соответствующей -35 элементу (взаимодействия района сигма4, которые осуществляются при участии домена бета flap), и левее от него (взаимодействия альфаCTD-доменов). Для проверки роли взаимодействий РНКП с участком ДНК левее -35 элемента в узнавании sTap2-промотора определена активность РНКП T. aquaticus на укороченном варианте sTap2-промотора (sTap2-up) с делецией этого участка (удален участок ДНК левее -38 нт относительно старта транскрипции). Установлено значительное уменьшение активности РНКП T. aquaticus дикого типа при таком варианте промотора в сравнении с полноразмерным sTap2-промотором ( Рис. 3.4 ). В то же время, РНКП с делецией альфаCTD-доменов обладает примерно одинаковым уровнем активности на полноразмерном и укороченном вариантах sTap2-промотора ( Рис. 3.4 ). Следовательно, альфаCTD стимулирует активность РНКП на sTap2-промоторе за счет контактов с 5'-концевой частью промотора (удаленной в sTap2-up), и указывает на важную функциональную роль альфаCTD в узнавании данного типа промоторов. Так как промотор sTap2 не содержит в своем составе UP-элемента, который специфически узнавался бы альфаCTD, можно сделать вывод, что стимуляция транскрипции осуществляется за счет неспецифических контактов альфаCTD с промоторной ДНК.
Все три делеции (альфаCTD, сигма4 и бетаflap) также нарушают узнавание промоторов Т7A1 и sTap2+35-GGGA, содержащих в своем составе - 10 и -35 элементы, но не GGGA ( Рис. 3.4 ). Очевидно, эти домены необходимы для эффективного узнавания РНКП T. aquaticus "классических" промоторов -10/-35-класса. При этом важным отличием от узнавания sTap2- промотора, не содержащего -35 элемента, является то, что домен сигма4 (и взаимодействующий с ним бетаflap-домен) в случае промоторов Т7A1 и sTap2+35-GGGA задействован в специфическом узнавании -35 элемента.
Наиболее интересными свойствами обладает промотор sTap2+35, содержащий -10, -35 и GGGA-элементы и узнаваемый РНКП T. aquaticus наибольшей эффективностью ( Рис. 3.4 ). Обнаружено, что, в то время как РНКП с делецией района 4 сигма-субъединицы не активна на данном промоторе, делеции альфаCTD и бетаflap не влияют существенно на активность РНКП ( Рис. 3.4 ). Таким образом, одновременное наличие трех промоторных элементов обеспечивает эффективное узнавание промотора даже в отсутствие контактов альфаCTD с промоторной ДНК. Кроме того, из полученных данных следует, что, вопреки высказанной ранее гипотезе ( Kuznedelov et al., 2002b ), район 4 сигма-субъединицы способен взаимодействовать с -35 элементом даже в отсутствие бетаflap-домена.
Для узнавания GGGA-содержащих промоторов РНКП T. aquaticus необходимы альфаСTD, сигма4 и бетаflap-домены, участвующие, вероятно, в неспецифических взаимодействиях с промоторной ДНК. Установлено, что различия в узнавании GGGA-содержащих промоторов РНКП T. aquaticus и E. coli не зависят от специфических взаимодействий РНКП с промоторными элементами, а определяются кор-ферментом РНКП (см. " Узнавание GGGA-элемента РНКП E. coli "). Вероятно степень изменения узнавания определяется изменениями в неспецифических взаимодействиях РНКП с ДНК, в частности, во взаимодействиях альфаСTD с участком промотора левее -35 элемента. При проверке этого предположения показано, что замена лямбдаCTD влияет на специфичность узнавания sTap2-промотора РНКП T. aquaticus ( Рис. 3.5 ). Возможным объяснением наблюдаемых различий в узнавании sTap2-промотора РНКП T. aquaticus и E. coli является способность С-концевых доменов альфа-субъединиц РНКП T. aquaticus осуществлять неспецифические взаимодействия с промоторной ДНК левее -35 элемента с большей эффективностью.
На сегодняшний день в научной литературе отсутствуют какие-либо данные о роли контактов лямбдаCTD с ДНК в межвидовых различиях в узнавании промоторов. В то же время, ранее было показано, что кор- фермент РНКП способен во многом определять межвидовые различия в инициации транскрипции ( Aniskovitch and Winkler, 1995 ; Artsimovitch et al., 2000 ; Ramirez-Romero et al., 2006 ). На основании проведенных исследований можно предположить, что эти различия могут, в частности, объясняться изменениями в неспецифических и специфических контактах лямбдаCTD с ДНК.
